【摘要】：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是嚴(yán)重危害人類健康的自身免疫性疾病,患者體內(nèi)針對自身核抗原產(chǎn)生高水平的自身抗體如抗雙鏈DNA抗體(anti-dsDNA Ab),形成免疫復(fù)合物,沉積于全身各組織基底膜導(dǎo)致慢性炎癥損傷,臨床表現(xiàn)為病情反復(fù)、遷延不愈,其發(fā)病機(jī)制仍不清楚。研究表明自身核成分可能是SLE發(fā)病的自身免疫原；但在正常情況下,哺乳動(dòng)物DNA等核成分的免疫原性較差,一般不能在動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生；但是抗雙鏈DNA抗體的存在又提示DNA可能是其免疫原,因而闡明自身DNA如何打破免疫耐受從而激活免疫系統(tǒng)是闡明SLE發(fā)病機(jī)制的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。 我們實(shí)驗(yàn)室在尋找SLE疾病自身免疫原的過程中發(fā)現(xiàn)：活化淋巴細(xì)胞來源的DNA (Activated Lymphocyte-derived DNA, ALD-DNA)免疫同系BALB/c小鼠能誘導(dǎo)以血清高水平抗dsDNA抗體、蛋白尿、腎小球腎炎和腎臟免疫復(fù)合物熒光沉積為典型表現(xiàn)的SLE樣綜合征；而在相同條件下,正常淋巴細(xì)胞來源的DNA (UnALD-DNA)卻不能誘導(dǎo)SLE疾病的發(fā)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),ALD-DNA可通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化分泌炎癥細(xì)胞因子,從而導(dǎo)致SLE的發(fā)生；但是,ALD-DNA活化巨噬細(xì)胞的具體機(jī)制還不清楚。 高遷移率族蛋白Bl (high mobility group protein Bl, HMGB1)由A盒和B盒及C端尾部結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,是廣泛存在于真核細(xì)胞核中最重要的非組蛋白。研究發(fā)現(xiàn),HMGB1能夠結(jié)合各種核酸成分,并活化下游核酸特異性受體,從而誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌大量炎性細(xì)胞因子,在機(jī)體免疫系統(tǒng)對核酸成分應(yīng)答的過程中可能扮演者重要角色；HMGB1也被認(rèn)為是一種固有免疫危險(xiǎn)信號(danger signal)或一種可能的分泌型固有免疫識別受體(PRR)。HMGB1是否在ALD-DNA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化和SLE發(fā)病中發(fā)揮作用及其可能機(jī)制引起了我們的關(guān)注。 基于我們的前期研究以及國內(nèi)外相關(guān)研究的現(xiàn)狀,推測HMGB1作為機(jī)體組織細(xì)胞或免疫細(xì)胞釋放的危險(xiǎn)信號,感知危險(xiǎn)的大量釋放的自身凋亡DNA,而后激活巨噬細(xì)胞的固有免疫,從而啟動(dòng)自身免疫應(yīng)答。本課題旨在探討HMGB1在ALD-DNA活化巨噬細(xì)胞過程中的作用及其機(jī)制,并進(jìn)一步研究其在ALD-DNA誘導(dǎo)的SLE發(fā)病中的作用,以期為SLE的防治提供新的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分HMGB1在ALD-DNA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化中的作用 我們研究發(fā)現(xiàn),ALD-DNA可有效誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化,明顯上調(diào)巨噬細(xì)胞表面協(xié)同刺激分子的表達(dá),并顯著誘導(dǎo)其分泌IL-6,IL-12和TNF--α等炎性細(xì)胞因子。有趣的是,我們發(fā)現(xiàn)ALD-DNA能夠顯著誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的HMBG1的分泌,且HMGB1的分泌表達(dá)水平和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生呈正相關(guān),對ALD-DNA刺激具有明顯的劑量依賴效應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),應(yīng)用siRNA下調(diào)HMGB1的表達(dá)可以明顯抑制ALD-DNA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生以及HMGB1的分泌；應(yīng)用胞外HMGB1的特異性阻斷劑A盒肽能夠顯著抑制ALD-DNA誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子分泌,并呈劑量依賴效應(yīng)；提示HMGB1參與了ALD-DNA激活的巨噬細(xì)胞活化。進(jìn)一步研究HMGB 1對巨噬細(xì)胞的活化作用,發(fā)現(xiàn)：以單純HMGB1蛋白作用巨噬細(xì)胞,不能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的分泌,排除了HMGB1本身具有誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化的作用。而外源性HMGB 1蛋白能夠顯著上調(diào)ALD-DNA而不是UnALD-DNA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子分泌,提示,胞外HMGB1在ALD-DNA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化中具有關(guān)鍵作用。 進(jìn)一步應(yīng)用競爭性ELISA結(jié)合實(shí)驗(yàn)和圓二色譜分析方法檢測HMGB]和ALD-DNA的結(jié)合情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HMGB1可以有效地與ALD-DNA結(jié)合形成復(fù)合物,并具有劑量依賴效應(yīng)。已知HMGB1的巨噬細(xì)胞識別受體為TLR2、TLR4和RAGE,為進(jìn)一步研究HMGB 1-ALD-DNA復(fù)合物誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子分泌的受體通路和分子機(jī)制,我們首先應(yīng)用TLR2/4抑制劑觀察TLR2和TLR4是否參與ALD-DNA-HMGB1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TLR2/4抑制劑對ALD-DNA的巨噬細(xì)胞活化沒有明顯影響;進(jìn)一步用RAGE siRNA和RAGE-Fc分別抑制RAGE的表達(dá)和作用,再以ALD-DNA刺激巨噬細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)RAGE siRNA和RAGE-Fc均能顯著抑制ALD-DNA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的分泌,提示RAGE對HMGB1的識別介導(dǎo)了ALD-DNA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化。 以上研究結(jié)果表明,ALD-DNA刺激巨噬細(xì)胞分泌HMGB 1,并與其結(jié)合形成炎性復(fù)合物,通過RAGE信號通路啟動(dòng)免疫應(yīng)答,這可能是ALD-DNA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化的重要機(jī)制之一 第二部分HMGB1在ALD-DNA誘導(dǎo)SLE發(fā)病中的作用 為深入探討HMGB1在ALD-DNA誘導(dǎo)SLE發(fā)病中的可能作用,我們進(jìn)行體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn),檢測了ALD-DNA免疫小鼠血清中HMGB1的水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ALD-DNA免疫小鼠血清中的HMGB1水平顯著高于正常DNA免疫組和正常對照組小鼠,提示HMGB1可能參與了ALD-DNA誘導(dǎo)的SLE的發(fā)病。為了驗(yàn)證HMGB1在ALD-DNA誘導(dǎo)SLE疾病中的作用,我們通過肌肉注射HMGB1真核過表達(dá)質(zhì)粒來上調(diào)小鼠體內(nèi)HMGB1的水平,并通過腹腔注射HMGB1的體內(nèi)抑制劑甘草皂苷來抑制小鼠體內(nèi)HMGB1的作用,同時(shí)以ALD-DNA免疫小鼠3次,誘導(dǎo)SLE樣綜合癥。結(jié)果發(fā)現(xiàn),HMGB1過表達(dá)組小鼠經(jīng)ALD-DNA免疫后,其血清HMGB1水平、抗雙鏈DNA抗體和尿蛋白水平均明顯上調(diào),腎臟病理改變更為嚴(yán)重；而胞外HMGB1的體內(nèi)阻斷劑顯著下調(diào)了ALD-DNA免疫小鼠誘導(dǎo)的抗雙鏈DNA抗體和尿蛋白水平,并且未觀察到明顯腎腎臟病理改變；提示HMGB1在ALD-DNA誘導(dǎo)的SLE發(fā)病中具有重要作用。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),ALD-DNA刺激HMGB1過表達(dá)免疫小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞分泌的炎性細(xì)胞因子水平明顯高于甘草皂苷抑制組小鼠,提示體內(nèi)HMGB1在巨噬細(xì)胞對ALD-DNA的刺激反應(yīng)中具有重要作用,這也可能是二者SLE發(fā)病嚴(yán)重程度不同的機(jī)制之一。 本研究在ALD-DNA誘導(dǎo)小鼠SLE綜合癥的動(dòng)物模型基礎(chǔ)上,關(guān)注一種新的固有免疫DNA感受器-HMGBl,證實(shí)其在ALD-DNA刺激的巨噬細(xì)胞及小鼠體內(nèi)顯著上調(diào)分泌；HMGB1可直接結(jié)合ALD-DNA,并通過巨噬細(xì)胞RAGE信號通路激活巨噬細(xì)胞,并在ALD-DNA誘導(dǎo)的SLE發(fā)病中發(fā)揮重要作用。本研究為闡明SLE發(fā)病的固有免疫識別機(jī)制和調(diào)控提供了新的數(shù)據(jù)和思路,并提供了基于HMGB1的SLE治療新靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉f，

本文編號：2574094