【摘要】：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus, SLE)是嚴重危害人類健康的自身免疫性疾病,患者體內(nèi)針對自身核抗原產(chǎn)生高水平的自身抗體如抗雙鏈DNA抗體(anti-dsDNA Ab),形成免疫復合物,沉積于全身各組織基底膜導致慢性炎癥損傷,臨床表現(xiàn)為病情反復、遷延不愈,其發(fā)病機制仍不清楚。研究表明自身核成分可能是SLE發(fā)病的自身免疫原；但在正常情況下,哺乳動物DNA等核成分的免疫原性較差,一般不能在動物體內(nèi)誘導抗體產(chǎn)生；但是抗雙鏈DNA抗體的存在又提示DNA可能是其免疫原,因而闡明自身DNA如何打破免疫耐受從而激活免疫系統(tǒng)是闡明SLE發(fā)病機制的熱點和重點。 我們實驗室在尋找SLE疾病自身免疫原的過程中發(fā)現(xiàn)：活化淋巴細胞來源的DNA (Activated Lymphocyte-derived DNA, ALD-DNA)免疫同系BALB/c小鼠能誘導以血清高水平抗dsDNA抗體、蛋白尿、腎小球腎炎和腎臟免疫復合物熒光沉積為典型表現(xiàn)的SLE樣綜合征；而在相同條件下,正常淋巴細胞來源的DNA (UnALD-DNA)卻不能誘導SLE疾病的發(fā)生。進一步研究發(fā)現(xiàn),ALD-DNA可通過誘導巨噬細胞活化分泌炎癥細胞因子,從而導致SLE的發(fā)生；但是,ALD-DNA活化巨噬細胞的具體機制還不清楚。 高遷移率族蛋白Bl (high mobility group protein Bl, HMGB1)由A盒和B盒及C端尾部結構域構成,是廣泛存在于真核細胞核中最重要的非組蛋白。研究發(fā)現(xiàn),HMGB1能夠結合各種核酸成分,并活化下游核酸特異性受體,從而誘導巨噬細胞分泌大量炎性細胞因子,在機體免疫系統(tǒng)對核酸成分應答的過程中可能扮演者重要角色；HMGB1也被認為是一種固有免疫危險信號(danger signal)或一種可能的分泌型固有免疫識別受體(PRR)。HMGB1是否在ALD-DNA誘導巨噬細胞活化和SLE發(fā)病中發(fā)揮作用及其可能機制引起了我們的關注。 基于我們的前期研究以及國內(nèi)外相關研究的現(xiàn)狀,推測HMGB1作為機體組織細胞或免疫細胞釋放的危險信號,感知危險的大量釋放的自身凋亡DNA,而后激活巨噬細胞的固有免疫,從而啟動自身免疫應答。本課題旨在探討HMGB1在ALD-DNA活化巨噬細胞過程中的作用及其機制,并進一步研究其在ALD-DNA誘導的SLE發(fā)病中的作用,以期為SLE的防治提供新的理論基礎和實驗依據(jù)。 第一部分HMGB1在ALD-DNA誘導巨噬細胞活化中的作用 我們研究發(fā)現(xiàn),ALD-DNA可有效誘導巨噬細胞活化,明顯上調(diào)巨噬細胞表面協(xié)同刺激分子的表達,并顯著誘導其分泌IL-6,IL-12和TNF--α等炎性細胞因子。有趣的是,我們發(fā)現(xiàn)ALD-DNA能夠顯著誘導巨噬細胞的HMBG1的分泌,且HMGB1的分泌表達水平和炎性細胞因子的產(chǎn)生呈正相關,對ALD-DNA刺激具有明顯的劑量依賴效應。進一步研究發(fā)現(xiàn),應用siRNA下調(diào)HMGB1的表達可以明顯抑制ALD-DNA誘導的巨噬細胞炎性細胞因子的產(chǎn)生以及HMGB1的分泌；應用胞外HMGB1的特異性阻斷劑A盒肽能夠顯著抑制ALD-DNA誘導的炎性細胞因子分泌,并呈劑量依賴效應；提示HMGB1參與了ALD-DNA激活的巨噬細胞活化。進一步研究HMGB 1對巨噬細胞的活化作用,發(fā)現(xiàn)：以單純HMGB1蛋白作用巨噬細胞,不能誘導巨噬細胞炎性細胞因子的分泌,排除了HMGB1本身具有誘導巨噬細胞活化的作用。而外源性HMGB 1蛋白能夠顯著上調(diào)ALD-DNA而不是UnALD-DNA誘導的巨噬細胞炎性細胞因子分泌,提示,胞外HMGB1在ALD-DNA誘導的巨噬細胞活化中具有關鍵作用。 進一步應用競爭性ELISA結合實驗和圓二色譜分析方法檢測HMGB]和ALD-DNA的結合情況。結果發(fā)現(xiàn)HMGB1可以有效地與ALD-DNA結合形成復合物,并具有劑量依賴效應。已知HMGB1的巨噬細胞識別受體為TLR2、TLR4和RAGE,為進一步研究HMGB 1-ALD-DNA復合物誘導炎性細胞因子分泌的受體通路和分子機制,我們首先應用TLR2/4抑制劑觀察TLR2和TLR4是否參與ALD-DNA-HMGB1誘導的巨噬細胞活化,結果發(fā)現(xiàn)TLR2/4抑制劑對ALD-DNA的巨噬細胞活化沒有明顯影響;進一步用RAGE siRNA和RAGE-Fc分別抑制RAGE的表達和作用,再以ALD-DNA刺激巨噬細胞,結果發(fā)現(xiàn)RAGE siRNA和RAGE-Fc均能顯著抑制ALD-DNA誘導巨噬細胞炎性細胞因子的分泌,提示RAGE對HMGB1的識別介導了ALD-DNA誘導的巨噬細胞活化。 以上研究結果表明,ALD-DNA刺激巨噬細胞分泌HMGB 1,并與其結合形成炎性復合物,通過RAGE信號通路啟動免疫應答,這可能是ALD-DNA誘導巨噬細胞活化的重要機制之一 第二部分HMGB1在ALD-DNA誘導SLE發(fā)病中的作用 為深入探討HMGB1在ALD-DNA誘導SLE發(fā)病中的可能作用,我們進行體內(nèi)動物試驗,檢測了ALD-DNA免疫小鼠血清中HMGB1的水平,結果發(fā)現(xiàn)ALD-DNA免疫小鼠血清中的HMGB1水平顯著高于正常DNA免疫組和正常對照組小鼠,提示HMGB1可能參與了ALD-DNA誘導的SLE的發(fā)病。為了驗證HMGB1在ALD-DNA誘導SLE疾病中的作用,我們通過肌肉注射HMGB1真核過表達質(zhì)粒來上調(diào)小鼠體內(nèi)HMGB1的水平,并通過腹腔注射HMGB1的體內(nèi)抑制劑甘草皂苷來抑制小鼠體內(nèi)HMGB1的作用,同時以ALD-DNA免疫小鼠3次,誘導SLE樣綜合癥。結果發(fā)現(xiàn),HMGB1過表達組小鼠經(jīng)ALD-DNA免疫后,其血清HMGB1水平、抗雙鏈DNA抗體和尿蛋白水平均明顯上調(diào),腎臟病理改變更為嚴重；而胞外HMGB1的體內(nèi)阻斷劑顯著下調(diào)了ALD-DNA免疫小鼠誘導的抗雙鏈DNA抗體和尿蛋白水平,并且未觀察到明顯腎腎臟病理改變；提示HMGB1在ALD-DNA誘導的SLE發(fā)病中具有重要作用。我們進一步研究發(fā)現(xiàn),ALD-DNA刺激HMGB1過表達免疫小鼠體內(nèi)巨噬細胞分泌的炎性細胞因子水平明顯高于甘草皂苷抑制組小鼠,提示體內(nèi)HMGB1在巨噬細胞對ALD-DNA的刺激反應中具有重要作用,這也可能是二者SLE發(fā)病嚴重程度不同的機制之一。 本研究在ALD-DNA誘導小鼠SLE綜合癥的動物模型基礎上,關注一種新的固有免疫DNA感受器-HMGBl,證實其在ALD-DNA刺激的巨噬細胞及小鼠體內(nèi)顯著上調(diào)分泌；HMGB1可直接結合ALD-DNA,并通過巨噬細胞RAGE信號通路激活巨噬細胞,并在ALD-DNA誘導的SLE發(fā)病中發(fā)揮重要作用。本研究為闡明SLE發(fā)病的固有免疫識別機制和調(diào)控提供了新的數(shù)據(jù)和思路,并提供了基于HMGB1的SLE治療新靶點。
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2574094