【摘要】：酸敏感離子通道(acid-sensing ion channels, ASICs)屬于上皮鈉通道degenerin/epithelial Na+ channel (DEG/ENaC)家族,是一種由細(xì)胞外的質(zhì)子激活的非選擇性陽(yáng)離子通道。到目前為止,由四種基因編碼的6種酸敏感離子通道亞基己被鑒定,分別是亞型ASICla、1b、2a,2b、3、4。它們分別分布在中樞和外周的神經(jīng)系統(tǒng)中,并在諸多的生理和病理功能中發(fā)揮作用。在外周神經(jīng)系統(tǒng)中,ASICs發(fā)揮感覺(jué)感受器的作用,例如傷害感受和機(jī)械感受。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,ASICs與突觸可塑性,學(xué)習(xí)記憶、恐懼記憶,腦缺血性損傷、癲癇和神經(jīng)免疫等生理和病理活動(dòng)相關(guān)。伴隨著ASIC晶體結(jié)構(gòu)得到解析的“后晶體時(shí)代”的到來(lái),以其晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的研究也越來(lái)越多地涌現(xiàn)。本文也基于ASIC的晶體結(jié)構(gòu),對(duì)通道的表達(dá)調(diào)控和開(kāi)放的結(jié)構(gòu)機(jī)制進(jìn)行了研究。由于ASICs是由細(xì)胞外質(zhì)子激活的膜離子通道,所以理解ASICs在膜表面的分布,對(duì)于酸化條件下的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是必須的。在本論文第一部分的研究中,我們著重描述了存在于ASIC3型胞外手指域的一對(duì)由D107-R153組成的保守鹽橋(對(duì)應(yīng)于ASIC1a通道的為D107-R160)在ASICs中的功能和結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。我們使用點(diǎn)突變結(jié)合電生理檢測(cè),發(fā)現(xiàn)這對(duì)鹽橋在ASICs的功能發(fā)揮中是至關(guān)重要的,即針對(duì)鹽橋的任何微小的破壞都會(huì)導(dǎo)致整個(gè)通道電生理功能的下降或喪失,且這種作用并不是來(lái)自于ASICs pH感受性的下降。將突變體通道轉(zhuǎn)染細(xì)胞并用生物素-親和素法在突變通道上提取細(xì)胞膜蛋白后用Western-blotting法進(jìn)行半定量分析,以及使用HA標(biāo)記膜表面后進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明,這對(duì)鹽橋中細(xì)微結(jié)構(gòu)的破壞會(huì)導(dǎo)致通道上膜水平的降低。分子動(dòng)力學(xué)模擬,簡(jiǎn)正模式分析以及在鹽橋周圍的殘基進(jìn)行更多突變氨基酸篩選的結(jié)果表明此對(duì)鹽橋具有很高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和剛性,而這種剛性作用將鹽橋附近影響上膜的剛性區(qū)域“信號(hào)斑”(signal patch)和柔性較大的門(mén)控區(qū)域(gating domain)從結(jié)構(gòu)上分隔開(kāi),從而在ASIC的上膜功能中發(fā)揮重要作用。此外,鹽橋和其毗鄰的“信號(hào)斑”一起形成的剛性區(qū)域,可能是ASIC蛋白在裝配上膜的過(guò)程中所需伴侶蛋白的潛在結(jié)合位點(diǎn)。本研究在國(guó)際上首次發(fā)現(xiàn)了ASIC在膜上正常表達(dá)所必須的一種胞外結(jié)構(gòu)并推測(cè)了其作用的可能結(jié)構(gòu)機(jī)制。此發(fā)現(xiàn)可以用來(lái)評(píng)價(jià)源于組織酸化、激活A(yù)SIC相關(guān)過(guò)度興奮性和針對(duì)神經(jīng)損傷的預(yù)防策略研究。通常情況下,ASIC3由質(zhì)子誘導(dǎo)的電流分為兩相：一相是瞬間激活并失活的峰電流,另一相是隨之而來(lái)較小的持續(xù)平臺(tái)電流。ASIC3通道的持續(xù)激活可能參與了酸化有關(guān)的痛覺(jué)感受以及感覺(jué)整合。對(duì)于ASIC3通道持續(xù)電流結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的研究為針對(duì)ASICs新型鎮(zhèn)痛藥的研發(fā)提供了可能。其作為本論文第二部分的研究,我們利用一種能顯著增強(qiáng)ASIC3持續(xù)電流的生物體內(nèi)源性小分子多肽FMRF-NH2作為探針,來(lái)研究ASIC3持續(xù)電流的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和分子機(jī)制。使用定點(diǎn)突變,電生理檢測(cè),化學(xué)合成,共價(jià)修飾,以及分子動(dòng)力學(xué)模擬,我們發(fā)現(xiàn)了一個(gè)存在于胞外域三個(gè)亞基交界面上的E79-E423-Q269-Q271 (EEQQ)相互作用復(fù)合體。EEQQ復(fù)合體參與了ASIC3通道在酸化下的持續(xù)電流的產(chǎn)生；在復(fù)合體上的單突變或共價(jià)修飾都能導(dǎo)致酸化下持續(xù)電流大小的變化。更多的分子動(dòng)力學(xué)模擬,簡(jiǎn)正模式分析以及雙突變循環(huán)分析結(jié)果反映出EEQQ復(fù)合體作為一個(gè)開(kāi)關(guān),通過(guò)構(gòu)象變化機(jī)制,控制β-linker結(jié)構(gòu)與拇指域的結(jié)合與解離,從而產(chǎn)生使ASIC3通道脫敏或持續(xù)激活的不同效果。本研究結(jié)果解釋了ASIC一種內(nèi)源性調(diào)節(jié)的具體機(jī)制,并在以往ASIC門(mén)控的研究基礎(chǔ)上提出了通道持續(xù)開(kāi)放的新構(gòu)象傳導(dǎo)通路,為開(kāi)發(fā)治療炎癥痛等疾病的新型藥物提供了全新的結(jié)構(gòu)模型和新的干預(yù)途徑。
【圖文】：

Ｆｉｇｕｒｅ邋３．１邋Ｔｈｒｅｅ邋ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ邋ａｎｄ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ａｌｉｇｎｍｅｎｔ邋ｏｆ邋ｄｉｅ邋Ｄ－民邋ｉｒＵｅｒａｃｔｉｏｎ邋ｉ＊ｅｇｉｏｎ逡逑．ａｔ邋化ｅ邋ｅｄｇｅ邋ｏｆ邋化ｅ邋ｆｉｎｇｅｒ邋ｄｏｍａｉｎ邋ｏｆ邋ＡＳＩＣｓ．逡逑圖３．１在ＡＳＩＣｓ家族中，手指域上Ｄ－Ｒ氨基酸殘基相互作用對(duì)的王維結(jié)構(gòu)和序列比對(duì)。逡逑４邋Ｓ化ｒｅｏ邋ｖｉｅｗ邋ｏｆ邋化ｅ邋ｃｒｙｓｔａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ｃＡＳＩＣｌ邋（ＰＤ艮邋ｃｏｄｅ：邋３ＨＧＣ）邋ｗｉ化邋ｋｅｙ邋化ｓｉｄｕｅｓ逡逑（ｄｉｓｐｌａｙｅｄ邋ｉｎ邋ｇｒｅｙ邋ｓｔｉｃｋｓ邋ｆｏｒ邋ｅｍｐｈａｓｉｓ）邋ｉｎｖｏｌｖｅｄ邋ｉｎ邋ｆｏｒｍｉｎｇ邋化ｅ邋Ｄ１０８－民邋１６１邋ｓａｌｔ－ｂｒｉｄｇｅ邋ｅｎｌａｒｇｅｄ．逡逑Ｒｅｄ邋ｂｒｏｋｅｎ邋ｌｉｎｅｓ邋ｉｎｄｉｃａｔｅ邋ｈｙｄｒｏｇｅｎ邋ｂｏｎｄｉｎｇ邋ａｍｏｎｇ邋ｐｏｌａｒ邋ｒｅｓｉｄｕｅｓ．邋Ｂ，邋Ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ａｌｉｇｎｍｅｎｔ邋ｏｆ邋ａｌｌ逡逑ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ＡＳＩＣ邋ｃｈａｎｎｅｌｓ邋ａｔ邋化ｅ邋ｃｏｎ化ｒｖｅｄ邋ｓａｌｔ－ｂｒｉｄｇｅ邋ａｎｄ邋ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｒｅｓｉｄｕｅｓ．邋Ｔｈｅ邋ｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ邋ｉｓ逡逑ｂａｓｅｄ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｒＡＳＩＣ３邋ｃｈａｎｎｅｌ．逡逑Ａ邋ｃＡＳＩＣｌ的晶體結(jié)構(gòu)圖（陽(yáng)Ｂ碼：３ＨＧＣ，，上圖），形成Ｄ１０８－Ｒ１６１鹽橋的關(guān)鍵氨基酸逡逑殘基放大Ｗ棒狀顯示于下圖（灰色）。紅色虛線代表在極性殘基之間形成的氨鍵。６

ｐＨｓｏ逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．２邋巨ｆｆｅｃｔｓ邋ｏｆ邋ｍｕｔａｔｉｏｎｓ邋ａｔ邋化ｅ邋ｓａｌｔ－ｂｒｉｄｇｅ邋ｏｎ邋ａｃｉｄ－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｃｕｒｒｅｎｔｓ邋ｉｎ邋ＡＳＩＣ３邋ｃｈａｎｎｅｌｓ．逡逑圖３．２邋ＡＳＩＣ３上鹽橋的突變對(duì)于酸誘導(dǎo)電流的作用。逡逑？逡逑斗艮ｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ邋ｐＨ邋５．０－ｉｎｄｕｃｅｄ邋ｃｕｒｒｅｎｔ邋ｔｒａｃｅｓ邋ｏｆ邋ＡＳＩＣ３－ＷＴ邋ａｎｄ邋ＡＳＩＣ３邋ｍｕｔａｎｔｓ，邋Ｄ１０７Ａ，逡逑民邋１５３Ａ，Ｑ１４９Ａ邋ａｎｄ邋Ｔ１０４Ａ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ｉｎ邋ＣＨＯ邋ｃｅｌｌｓ．公，Ｐｏｏｌｅｄ邋ｄａｔａ邋ｓｈｏｗｉｎｇ邋ａｃｉｄ－ｉｎ加ｃｅｄ逡逑ｃｈａｎｇｅｓ邋ｉｎ邋ｃｕｒｒｅｎｔ邋ｄｅｎｓｉｔｙ邋ｏｆ邋ＷＴ邋ａｎｄ邋ｍｕｔａｔｉｏｎｓ邋ａｔ邋Ｄ１０７邋ａｎｄ邋Ｒ１５３邋ａｓ邋ｗｅｌｌ邋ａｓ邋ａｄｊａｃｅｎｔ邋ｒｅｓｉｄｕｅｓ逡逑Ｔ１０４邋ａｎｄ邋Ｑ１４９．邋Ｔｈｅ邋Ｅ＊７９Ａ化４扣八邋ｍｉＵａｎｔ邋ｗａｓ邋ｕ化ｄ邋ａｓ邋ａ邋ｌｏｓｓ－ｏｆ－ｆｕｎｃｔｉｏｎ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．邋Ｄａｔａ邋ａｒｅ逡逑ｍｅａｎｓ邋±邋ＳＥ邋ｆｒｏｍ邋ｆｉｖｅ邋ｔｏ邋ｔｅｎ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ．邋０．０１，邋＊／？＜邋０．０５，邋ｕｎｐａｉｒｅｄ邋／－ｔｅｓｔ邋ｖｅｒｓｕｓ邋化ｅ邋ＷＴ逡逑ｃｈａｎｎｅｌｓ邋（ｂｒｏｋｅｎ邋ｌｉｎｅ）．邋Ｃ，邋ｐＨｓｏ邋ｏｆ邋ＷＴ邋ｃｈａｎｎｅｌ邋ａｎｄ邋ａｌｌ邋ｍｕｔａｎｔｓ．邋＾ｐＨｓｏ邋ｗａｓ邋ｎｏｔ邋ｍｅａｓｕｒｅｄ邋ｄｕｅ邋ｔｏ逡逑ｔｈｅ邋ｌａｃｋ邋ｏｆ邋ｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ邋ｃｕｒｒｅｎｔｓ．邋＊＊ｐ邋＜邋０．０１
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：2574091