【摘要】：胚胎發(fā)育、高原低氧、傷口愈合、炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)生、缺血性疾病等等這一系列生理學(xué)和病理學(xué)的過(guò)程都與低氧有關(guān)。為了研究這些與低氧相關(guān)的疾病,人們建立了各種各樣的低氧模型,大致可以分為物理低氧模型和化學(xué)低氧模型兩類。雖然物理低氧模型能夠較好地模擬造成動(dòng)物或者細(xì)胞低氧損傷的低氧環(huán)境,但是建立過(guò)程相對(duì)繁瑣復(fù)雜,其中通常需要含有95%氮?dú)夂?%二氧化碳?xì)怏w的氣瓶和能夠維持低氧環(huán)境的密閉小室。氧氣分析儀同樣需要用來(lái)精確控制小室內(nèi)氧氣的濃度。化學(xué)低氧模型的建立需要低氧誘導(dǎo)劑,比如氯化鈷、去鐵敏、疊氮鈉等。氯化鈷和鐵離子螯合劑去鐵敏進(jìn)行低氧模擬的原理是與參與氧感知過(guò)程的鐵進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)。然而鈷元素是一種重金屬,容易引起組織和細(xì)胞中毒,并且鈷元素模擬的僅僅是低氧引起組織損傷整個(gè)過(guò)程的一部分,因此難以真正模擬低氧損傷。還有一種低氧模型其誘導(dǎo)劑是連二亞硫酸鈉,可以像物理缺氧那樣剝奪掉溶液中的溶解氧,從而造成低氧環(huán)境。但是,連二亞硫酸鈉屬于易燃品,遇水發(fā)生放熱反應(yīng),會(huì)生成亞硫酸鈉和有毒氣體二氧化硫,在模擬低氧環(huán)境的同時(shí)會(huì)帶來(lái)其他嚴(yán)重副反應(yīng)。因此,建立一種新的低氧模型進(jìn)行低氧相關(guān)機(jī)制的研究顯得尤為重要。 我們通過(guò)文獻(xiàn)分析了解到在工業(yè)上亞硫酸鈉一直作為一種氧剝奪劑用于鍋爐清洗中,可以避免鍋爐過(guò)快的氧化腐蝕。并且,亞硫酸鈉曾作為一種重要的食品添加劑用于食品保鮮,因?yàn)槠淇梢孕纬蔁o(wú)氧環(huán)境抑制微生物的生長(zhǎng)。亞硫酸鈉遇水不會(huì)發(fā)生放熱反應(yīng),也不會(huì)產(chǎn)生二氧化硫。以上可以表明,亞硫酸鈉作為一種氧剝奪劑用于生物學(xué)研究,具有連二亞硫酸鈉所不具備的諸多優(yōu)勢(shì),有可能是一種潛在的低氧誘導(dǎo)劑。 首先,我們?cè)u(píng)估了利用亞硫酸鈉在液體環(huán)境中建立低氧模型的可能性。結(jié)果表明,亞硫酸鈉能夠消耗掉水溶液中的溶解氧,并可在一定時(shí)間內(nèi)維持水溶液的低氧狀態(tài),而且這種低氧狀態(tài)及維持時(shí)間具有亞硫酸鈉的濃度依賴性。這表明亞硫酸鈉可以在液體環(huán)境中模擬低氧狀態(tài)。其次,我們利用亞硫酸鈉在秀麗線蟲(chóng)培養(yǎng)體系中建立了低氧模型。以物理低氧模型作為對(duì)照,我們?cè)u(píng)估了亞硫酸鈉處理后線蟲(chóng)不同株系死亡率的統(tǒng)計(jì)、咽部損傷程度評(píng)價(jià)、神經(jīng)元軸索斷裂情況和低氧誘導(dǎo)因子HIF-1表達(dá)水平變化。 我們分別選擇野生型線蟲(chóng)N2株系、缺氧耐受型線蟲(chóng)daf-2(e1370)株系和缺氧敏感型線蟲(chóng)daf-16(mu86)株系這三種不同株系,在缺氧處理后進(jìn)行死亡率統(tǒng)計(jì),證明亞硫酸鈉導(dǎo)致線蟲(chóng)死亡是由于缺氧造成的。結(jié)合不同濃度亞硫酸鈉處理后的線蟲(chóng)死亡率統(tǒng)計(jì)圖,我們發(fā)現(xiàn)2.0 g/L的亞硫酸鈉溶液可以替代物理缺氧模型。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析認(rèn)為兩者之間的線蟲(chóng)死亡率模式?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 線蟲(chóng)缺氧處理較短的時(shí)間并不能觀察到明顯的咽部空泡樣改變。結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們選擇處理利用亞硫酸鈉模擬缺氧處理16 h后進(jìn)行DIC效果觀察。從結(jié)果中我們同樣可以得出2.0 g/L的亞硫酸鈉可以在秀麗線蟲(chóng)中替代物理缺氧模型。缺氧處理同樣會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元出現(xiàn)損傷,具體表現(xiàn)為軸索斷裂、呈串珠樣改變。結(jié)果也同樣表明,2.0 g/L的亞硫酸鈉與物理缺氧處理所導(dǎo)致的損傷程度一致,可以替代物理缺氧模型在秀麗線蟲(chóng)中建立一種新的低氧模型。 經(jīng)不同濃度的亞硫酸鈉處理后,線蟲(chóng)CeHIF-1(F38A6.3a)和CeHIF-1(F38A6.3c)兩種變體都出現(xiàn)穩(wěn)定的表達(dá)上調(diào)。這表明亞硫酸鈉導(dǎo)致的低氧環(huán)境能夠激活線蟲(chóng)體內(nèi)的HIF-1低氧信號(hào)通路,從機(jī)制上肯定了亞硫酸鈉能夠用于低氧模型的建立。 低氧是造成神經(jīng)系統(tǒng)損傷的重要原因,臨床上以缺血缺氧性腦損傷為主的腦血管疾病給患者乃至整個(gè)社會(huì)帶來(lái)極大負(fù)擔(dān)。因此,揭示抗缺氧損傷的關(guān)鍵分子機(jī)制對(duì)臨床預(yù)防和治療此類疾病有著重大的現(xiàn)實(shí)意義。相應(yīng)地,對(duì)于包括腦中風(fēng)在內(nèi)的腦血管疾病相關(guān)治療藥物的研發(fā)一直是醫(yī)學(xué)界的研究重點(diǎn)。因此,我們還建立小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型(即腦中風(fēng)模型),用于評(píng)價(jià)連接有穿膜肽TAT標(biāo)簽的腦紅蛋白(Neuroglobin,Ngb)的神經(jīng)保護(hù)作用。腦紅蛋白是新發(fā)現(xiàn)的主要表達(dá)于脊椎動(dòng)物神經(jīng)元以及視網(wǎng)膜中的第三類攜氧珠蛋白。已有諸多報(bào)道認(rèn)為腦紅蛋白對(duì)由于缺氧或者缺血造成的腦損傷具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。目前已有證據(jù)表明Ngb可以作為活性氧簇(ROS)的清除劑有可能起到重要保護(hù)作用,但其神經(jīng)保護(hù)作用的具體機(jī)制依然不明。 我們采用線栓法建立小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型(MCAO)模型。同時(shí),優(yōu)化了TTC染色方法,這能夠?qū)Ｋ涝钗恢靡约懊娣e進(jìn)行精確判定,可顯著提高腦缺血模型中梗死灶的檢測(cè)效率。基于此模型,我們分析了小鼠給予尾靜脈注射不同濃度的TAT-Ngb蛋白后腦梗死面積的變化。結(jié)果表明,低濃度的TAT-Ngb能夠顯著減少腦缺血再灌注損傷導(dǎo)致的梗死面積。這可能與TAT標(biāo)簽?zāi)軌虼龠M(jìn)Ngb血腦屏障的透過(guò)率有關(guān)。 綜上可知,我們分析了亞硫酸鈉溶液中溶解氧含量的變化模式,并以此在秀麗線蟲(chóng)中建立了亞硫酸鈉低氧模型。另外,我們通過(guò)小鼠MCAO模型評(píng)價(jià)認(rèn)為T(mén)AT-Ngb具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。本研究對(duì)低氧損傷機(jī)制探索及相關(guān)低氧和腦保護(hù)藥物的研發(fā)具有重要的意義和參考價(jià)值。
【圖文】：

第一章 亞硫酸鈉溶液中的溶解氧及 pH 值該方法很好地解決了溶解氧測(cè)定儀測(cè)量靜止溶液時(shí)數(shù)值不斷降快速獲得穩(wěn)定的測(cè)量值。測(cè)定儀電極測(cè)定溶液溶解氧含量的原理依賴于氧化還原反應(yīng)O2+2H2O+4e à4OH4Ag+4Cl à4AgCl+4e的過(guò)程中，電極周?chē)娜芙庋醪粩啾幌�，所以在靜止的溶液偏低。只有加裝攪拌裝置后才能夠適用于實(shí)驗(yàn)室中溶解氧的測(cè)

圖 1.2 磁力攪拌器不同轉(zhuǎn)速對(duì)蒸餾水溶解氧含量測(cè)量結(jié)果的影響(23℃1.3 所示，磁力攪拌器不同轉(zhuǎn)速同樣會(huì)對(duì) 0.4 g/L 亞硫酸鈉溶液產(chǎn)生影響。當(dāng)置于 2 檔轉(zhuǎn)速下，溶液溶解氧含量為 0.3 mg/L，溶解氧含量也不斷升高。在最高的 6 檔速度下的溶解氧含量轉(zhuǎn)速?gòu)?6 檔依次降至 2 檔時(shí)，其溶解氧含量維持在 0.8 mg/L，，下降。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R-332

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