【摘要】：重金屬污染事件層出不窮,愈演愈烈,畜禽產(chǎn)品重金屬殘留不同程度超標,威脅人畜健康�？焖佟⒘畠r地監(jiān)測生境中重金屬是減小其對人類及動物危害的先決條件。建立更快速、更經(jīng)濟的免疫分析法檢測重金屬是生產(chǎn)及經(jīng)濟發(fā)展的需要。本研究旨在建立能夠穩(wěn)定分泌高親和力和特異性抗重金屬汞、銅和鋅的單克隆抗體的雜交瘤細胞株,克隆抗重金屬汞、銅和鋅單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因,建立其免疫分析方法并得到初步應用。 本研究將重金屬(汞、銅和鋅)通過雙功能螯合劑與血藍蛋白偶聯(lián)制備了免疫抗原,與牛血清白蛋白偶聯(lián)制備了檢測抗原。通過BCA法、紫外分光光度法、SDS-PAGE電泳和石墨爐原子吸收光譜法鑒定重金屬汞、銅和鋅螯合物人工抗原。用合成的免疫抗原免疫BALB/c小鼠,采用雜交瘤技術建立能穩(wěn)定分泌抗重金屬汞、銅和鋅單克隆抗體的雜交瘤細胞株,分析雜交瘤細胞的染色體,鑒定。通過抗體亞型鑒定試劑盒鑒定單克隆抗體的類和亞類,通過體內(nèi)誘導法大量制備并純化抗體,通過間接酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法檢測抗體效價、親和力和細胞株分泌抗體的穩(wěn)定性,間接競爭ELISA(IC-ELISA)法測定抗體的特異性。通過提取雜交瘤總RNA、RT-PCR,擴增抗體可變區(qū)基因,克隆測序分析該基因。采用矩陣實驗確定抗原抗體的最佳組合,通過對封閉物、pH值、離子強度等影響因子的研究,確定IC-ELISA的最佳工作參數(shù)。 研究結(jié)果表明:成功制備了汞、銅和鋅的免疫抗原和檢測抗原,并建立了能穩(wěn)定分泌特異性抗重金屬汞、銅和鋅單克隆抗體的雜交瘤細胞株分別為3G4-G5、9D11-F3和Z1A5,抗體均為IgM亞類,輕鏈為kappa型,親和力達10~9L/mol～10~(10)L/mol,半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為1.15μM、0.257μg/mL和0.628μg/mL,與其他金屬的交叉反應低。從雜交瘤細胞3G4-G5、9D11-F3和Z1A5中克隆得到了抗重金屬汞、銅和鋅單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因。在IC-ELISA最佳工作參數(shù)確定的情況下,建立定量測定金屬離子汞、銅和鋅的方法,檢測范圍(IC20～IC80)分別為0.15μM～9.0μM,0.055μg/mL～1.198μg/mL和0.062μg/mL～6.341μg/mL,最低檢測限分別為3.94×10~(-5)mM,0.0227μg/mL和0.015μg/mL。水樣中的汞、銅和鋅添加回收率為分別為88.9%～107.3%,87.4%～106.8%和88.6%～109.4%。 本研究成功制備了重金屬汞、銅和鋅抗原,建立了3株能穩(wěn)定分泌高親和力、高特異性抗重金屬汞、銅和鋅單克隆抗體的雜交瘤細胞,且克隆得到了抗重金屬汞、銅和鋅單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因,為下一步通過基因工程改造抗體奠定了基礎。建立重金屬汞、銅和鋅殘留IC-ELISA檢測法,并能有效地用于實驗室水樣的重金屬汞、銅和鋅殘留檢測,為重金屬汞、銅和鋅殘留檢測試劑盒的研發(fā)奠定了基礎,為農(nóng)畜產(chǎn)品及環(huán)境安全檢測提供了重要的工具,對提高風險評估工作的效率和質(zhì)量,保障食品安全有重要現(xiàn)實意義。
【圖文】：

金屬對土壤的污染工業(yè)廢棄物排放和農(nóng)業(yè)化肥的大量使用，土壤重金屬污染已經(jīng)[12]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)土壤的重金屬污染可通過食物鏈直接進入動物體土壤與大氣、水、巖石等是密切不可分開，大氣沉降、水污染壤重金屬污染。農(nóng)業(yè)土壤重金屬污染物主要為鎘、鉛、鉻、汞圖 1-1 2009 年七大水系水質(zhì)類別比例[10]Fig.1-1 The proportion of water categories of seven water systems in 2009

免疫抗原 Hg-ITCBE-KLH 的制備：稱取 10mg ITCBE 溶于 1mL DMSO 溶液，取150μL 轉(zhuǎn)入反應器，再加入濃度為 500mg/mL 的汞溶液 2.2μL，室溫反應 30min，然后同時加入0.4mL pH9.73的HEPES緩沖液和濃度為5.9g/L的KLH 1.695mL，調(diào)pH至9.0，室溫下攪拌反應 12h。檢測抗原 Hg-ITCBE-BSA 的制備：稱取 10 mg ITCBE 溶于 1mL DMSO 溶液，取180μL 轉(zhuǎn)入反應器，，再加入濃度為 500mg/mL 的汞溶液 2.6μL，室溫下反應 30min 后同時加入 0.4mL pH9.73 的 HEPES 緩沖液和 20mg BSA，調(diào)節(jié) pH 至 9.0，室溫下攪拌反應12h。檢測抗原 ITCBE-BSA 的制備：合成方法同上,用超純水代替金屬離子即可�？乖姆蛛x純化：CentriconYM-30 超濾離心管預先用 0.1mol/L 的乙二胺四乙酸（EDTA）溶液浸泡過夜后，再用 pH 為 9.73 的 HEPES 緩沖液沖洗。偶聯(lián)反應后，用超濾管 Centricon YM-30 對蛋白復合物進行分離純化，去除沒有參與反應的金屬、螯合劑和金屬-螯合劑復合物，分離純化時先用 pH 為 9.73 的 HEPES 緩沖液洗滌超濾管 1 次，圖 2-1 重金屬汞抗原螯合物的合成線路Fig.2-1 The synthetic route to the mecury antigen conjugates
【學位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2573602