發(fā)布時間：2020-01-23 09:00

【摘要】：腸道病毒71型(EV71)屬于微小核糖核酸病毒科(Picornavirdae),腸道病毒屬(Enterovirus, EV)。EV71的感染可以導致手足口病(HFMD),一般癥狀輕微,僅表現(xiàn)為皮疹或皰疹性咽峽炎,預后良好。重癥病例病情進展迅速,可表現(xiàn)為中樞神經系統(tǒng)受累和急性呼吸循環(huán)衰竭。人是EV71的唯一自然宿主,對EV71普遍易感,但以嬰幼兒和5歲以下兒童感染為主。 目前國內外實驗室診斷EV71感染的方法主要有病毒分離、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、中和試驗、免疫組化檢測、反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、核苷酸序列測定、基因芯片技術等,每種方法各有優(yōu)缺點,而目前基層實驗室尚缺乏快速和準確的診斷方法。 本次研究以不同免疫方案制備EV71抗血清,篩選最佳免疫方案,同時利用制備的EV71高價抗血清建立間接ELISA試驗方法,檢測本實驗室采集的咽拭子標本,對基層實驗室開展EV71早期診斷具有重要意義。 目的 1.比較不同免疫方案制備EV71抗血清的免疫效果,選擇最優(yōu)免疫方案,為下一步制備EV71單克隆抗體(McAb)奠定免疫基礎。 2.用制備的EV71抗血清建立間接ELISA試驗法,檢測HFMD患兒咽拭子標本中的EV71,評價其檢出效果。 方法 1.用EV71的SDLY107株感染RD細胞并收獲病毒,初步純化后用50%終點法測定病毒滴度,取一部分病毒液以紫外線燈(40w)照射對病毒進行滅活。 2.將BALB/c鼠隨機分為5組,每組9只。其中1-4組為實驗組,第5組為對照組。1、2組以滅活病毒免疫,3、4組以活病毒免疫,1、3組的免疫間隔時間為2周,2、4組為3周；第5組用磷酸鹽緩沖液(PBS)免疫,免疫間隔2周,每組各免疫4次。 3.末次免疫后摘眼球取血,用間接ELISA試驗法和中和試驗(固定病毒-稀釋抗血清)法分別檢測各組小鼠血清抗體滴度。 4.用RD細胞分離2010年山東省臨沂市HFMD暴發(fā)期間采集的44份患兒咽拭子標本中的病毒,RT-PCR法擴增病毒分離液中的EV71并測序鑒定,作為EV71檢出的“金標準”。 5.以咽拭子標本液作為包被抗原,制備的EV71抗血清作為一抗,辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠IgG作為二抗,建立間接ELISA試驗法檢測標本中的EV71,與RT-PCR的檢測結果進行比較。 結果 1.50%終點法測得EV71的病毒滴度為2×10-3.25/0.1ml,紫外線照射法完全滅活EV71的最短時間為30min。 2.ELISA結果顯示,4個實驗組均產生陽性抗體(A/A02.1),對照組抗體陰性(A/A02.1),1-5組吸光度(A)值依次為1.0817±0.2897、1.0296±0.3719、1.0748±0.3749、1.4929±0.2159、0.1687±0.0218。對其進行單因素方差分析,F=23.449,P0.05,差別有統(tǒng)計學意義,LSD-t檢驗結果,第4組與1、2、3組差別均有統(tǒng)計學意義(P0.05),而其余組差別無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 3.第4組(活病毒間隔3周免疫組)ELISA法測得抗體滴度為1.024×105,中和試驗法測得抗血清中和效價為1：64。 4.咽拭子標本接種RD細胞并盲傳二代后,100%出現(xiàn)細胞病變,經RT-PCR擴增并測序鑒定,均為EV71。 5.以EV71抗血清作為一抗,ELISA法檢測咽拭子標本,陽性率為100%,與RT-PCR檢測結果相比,靈敏度、特異度、符合率均為100%。 結論 1.不同免疫方案制備的EV71抗血清,抗體滴度不完全相同,其中活病毒間隔3周免疫組抗體滴度最高,可作為制得高滴度EV71抗血清的理想選擇,并為制備EV71McAb奠定免疫基礎。 2.以EV71建立的間接ELISA法可早期、快速、準確檢測患兒咽拭子標本中的EV71,與RT-PCR擴增病毒分離液的結果相比,靈敏度、特異度、符合率均為100%,可在基層實驗室推廣使用。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R373

【參考文獻】

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本文編號：2572229