【摘要】：PML-C與GINS2蛋白相互作用的胞內(nèi)驗(yàn)證 目的通過(guò)胞內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PML-C與GINS2蛋白之間的相互作用。 方法將誘餌蛋白質(zhì)粒pGBKT7-PML-C和文庫(kù)蛋白質(zhì)粒pACT2-GINS2共同轉(zhuǎn)化AH109酵母細(xì)胞，，通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)驗(yàn)證二者在活細(xì)胞內(nèi)的相互作用；構(gòu)建pCMV-HA-PML-C及pCMV-Myc-GINS2兩種真核表達(dá)載體并共轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞，利用免疫共沉淀技術(shù)驗(yàn)證二者之間的相互作用。 結(jié)果pGBKT7-PML-C誘餌蛋白質(zhì)粒和pACT2-GINS2靶蛋白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化AH109酵母細(xì)胞后，可見(jiàn)藍(lán)色陽(yáng)性克隆生長(zhǎng)；pCMV-HA-PML-C和pCMV-Myc-GINS2真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，共轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞，用兔抗HA多克隆抗體沉淀與HA-PML-C相互作用的蛋白后，用鼠抗Myc單克隆抗體進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，可以檢測(cè)到Myc-GINS2蛋白。 結(jié)論利用酵母雙雜交和免疫共沉淀技術(shù)在胞內(nèi)驗(yàn)證了PML-C與GINS2間存在相互作用。 PML(NLS-)與GINS2蛋白相互作用的胞內(nèi)驗(yàn)證 目的：通過(guò)間接免疫熒光技術(shù)和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PML（缺失核定位信號(hào)系統(tǒng)，NLS-）與GINS2蛋白之間的相互作用。 方法：構(gòu)建pCMV-HA-PML（NLS-）和pCMV-Myc-GINS2兩種真核表達(dá)載體并共轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞，利用間接免疫熒光和免疫共沉淀技術(shù)在胞內(nèi)驗(yàn)證二者之間的相互作用。 結(jié)果：成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pCMV-HA-PML（NLS-）及pCMV-Myc-GINS2，共轉(zhuǎn)染人胚腎293細(xì)胞，HA-PML（NLS-）蛋白使用抗HA的一抗和FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG，Myc-GINS2蛋白使用鼠抗Myc的一抗和TRITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG，在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到兩種蛋白在人胚腎293細(xì)胞內(nèi)的共定位；兔抗HA多克隆抗體沉淀與HA-PML（NLS-）相互作用的蛋白后，用鼠抗Myc單克隆抗體進(jìn)行Western blotting檢測(cè)，可以檢測(cè)到Myc-GINS2蛋白。 結(jié)論：利用間接免疫熒光技術(shù)和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PML（NLS-）與GINS2蛋白間存在特異性相互作用。 GINS2基因沉默對(duì)K562細(xì)胞和NB4細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制的研究 目的：通過(guò)構(gòu)建GINS2的短發(fā)卡RNA干擾載體，轉(zhuǎn)染K562和NB4細(xì)胞，觀察GINS2基因沉默對(duì)K562細(xì)胞和NB4細(xì)胞凋亡的影響，為探尋白血病的診療靶點(diǎn)及其分子作用機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。 方法：通過(guò)構(gòu)建GINS2的短發(fā)卡RNA干擾載體，轉(zhuǎn)染K562和NB4細(xì)胞，用G418篩選后，利用熒光定量PCR技術(shù)和免疫印跡檢測(cè)干擾效果；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，周期情況；間接免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白的定位及免疫印跡檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白，凋亡蛋白和信號(hào)通路蛋白的變化。 結(jié)果：成功構(gòu)建五組GINS2的短發(fā)卡RNA干擾載體，在兩株細(xì)胞中均有干擾效果，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率明顯上升，細(xì)胞周期阻滯在G2期，且與CyclinB1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位相關(guān)；免疫印跡檢測(cè)凋亡蛋白表達(dá)升高，并驗(yàn)證了細(xì)胞凋亡是通過(guò)P38MAPK信號(hào)通路發(fā)揮作用的。 結(jié)論：GINS2基因沉默后抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，凋亡率升高,細(xì)胞周期阻滯在G2期，且與P38MAPK信號(hào)通路相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Reiko Hayashi;Takako Arauchi;Moe Tategu;Yuya Goto;Kenichi Yoshida;;A Combined Computational and Experimental Study on the Structure-Regulation Relationships of Putative Mammalian DNA Replication Initiator GINS[J];Genomics Proteomics & Bioinformatics;2006年03期

本文編號(hào)：2570252