【摘要】：PML-C與GINS2蛋白相互作用的胞內(nèi)驗證 目的通過胞內(nèi)實驗驗證PML-C與GINS2蛋白之間的相互作用。 方法將誘餌蛋白質(zhì)粒pGBKT7-PML-C和文庫蛋白質(zhì)粒pACT2-GINS2共同轉(zhuǎn)化AH109酵母細胞，，通過酵母雙雜交技術(shù)驗證二者在活細胞內(nèi)的相互作用；構(gòu)建pCMV-HA-PML-C及pCMV-Myc-GINS2兩種真核表達載體并共轉(zhuǎn)染人胚腎293細胞，利用免疫共沉淀技術(shù)驗證二者之間的相互作用。 結(jié)果pGBKT7-PML-C誘餌蛋白質(zhì)粒和pACT2-GINS2靶蛋白質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化AH109酵母細胞后，可見藍色陽性克隆生長；pCMV-HA-PML-C和pCMV-Myc-GINS2真核表達載體構(gòu)建成功，共轉(zhuǎn)染人胚腎293細胞，用兔抗HA多克隆抗體沉淀與HA-PML-C相互作用的蛋白后，用鼠抗Myc單克隆抗體進行Western blotting檢測，可以檢測到Myc-GINS2蛋白。 結(jié)論利用酵母雙雜交和免疫共沉淀技術(shù)在胞內(nèi)驗證了PML-C與GINS2間存在相互作用。 PML(NLS-)與GINS2蛋白相互作用的胞內(nèi)驗證 目的：通過間接免疫熒光技術(shù)和免疫共沉淀實驗驗證PML（缺失核定位信號系統(tǒng)，NLS-）與GINS2蛋白之間的相互作用。 方法：構(gòu)建pCMV-HA-PML（NLS-）和pCMV-Myc-GINS2兩種真核表達載體并共轉(zhuǎn)染人胚腎293細胞，利用間接免疫熒光和免疫共沉淀技術(shù)在胞內(nèi)驗證二者之間的相互作用。 結(jié)果：成功構(gòu)建真核表達載體pCMV-HA-PML（NLS-）及pCMV-Myc-GINS2，共轉(zhuǎn)染人胚腎293細胞，HA-PML（NLS-）蛋白使用抗HA的一抗和FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG，Myc-GINS2蛋白使用鼠抗Myc的一抗和TRITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG，在激光共聚焦顯微鏡下可觀察到兩種蛋白在人胚腎293細胞內(nèi)的共定位；兔抗HA多克隆抗體沉淀與HA-PML（NLS-）相互作用的蛋白后，用鼠抗Myc單克隆抗體進行Western blotting檢測，可以檢測到Myc-GINS2蛋白。 結(jié)論：利用間接免疫熒光技術(shù)和免疫共沉淀實驗驗證PML（NLS-）與GINS2蛋白間存在特異性相互作用。 GINS2基因沉默對K562細胞和NB4細胞凋亡的影響及作用機制的研究 目的：通過構(gòu)建GINS2的短發(fā)卡RNA干擾載體，轉(zhuǎn)染K562和NB4細胞，觀察GINS2基因沉默對K562細胞和NB4細胞凋亡的影響，為探尋白血病的診療靶點及其分子作用機制的研究奠定基礎(chǔ)。 方法：通過構(gòu)建GINS2的短發(fā)卡RNA干擾載體，轉(zhuǎn)染K562和NB4細胞，用G418篩選后，利用熒光定量PCR技術(shù)和免疫印跡檢測干擾效果；流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，周期情況；間接免疫熒光檢測細胞周期蛋白的定位及免疫印跡檢測細胞周期蛋白，凋亡蛋白和信號通路蛋白的變化。 結(jié)果：成功構(gòu)建五組GINS2的短發(fā)卡RNA干擾載體，在兩株細胞中均有干擾效果，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率明顯上升，細胞周期阻滯在G2期，且與CyclinB1蛋白在細胞內(nèi)的定位相關(guān)；免疫印跡檢測凋亡蛋白表達升高，并驗證了細胞凋亡是通過P38MAPK信號通路發(fā)揮作用的。 結(jié)論：GINS2基因沉默后抑制細胞生長，凋亡率升高,細胞周期阻滯在G2期，且與P38MAPK信號通路相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R363

【參考文獻】

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1 Reiko Hayashi;Takako Arauchi;Moe Tategu;Yuya Goto;Kenichi Yoshida;;A Combined Computational and Experimental Study on the Structure-Regulation Relationships of Putative Mammalian DNA Replication Initiator GINS[J];Genomics Proteomics & Bioinformatics;2006年03期

本文編號：2570252