【摘要】：背景和目的：星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元的作用越來(lái)越受到重視,已知星形膠質(zhì)細(xì)胞可以釋放多種活性物質(zhì)對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生、突觸形成以及調(diào)節(jié)突觸傳遞等各種神經(jīng)元功能起重要調(diào)制作用。除了谷氨酸,星形膠質(zhì)細(xì)胞還可以釋放D-絲氨酸對(duì)神經(jīng)元長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)的產(chǎn)生起重要作用以及釋放ATP對(duì)神經(jīng)元活動(dòng)產(chǎn)生異突觸抑制,提示膠質(zhì)細(xì)胞可以通過(guò)釋放信號(hào)分子對(duì)突觸功能具有重要調(diào)節(jié)作用。另一方面,樹(shù)突棘形態(tài)和活動(dòng)狀態(tài)與突觸功能密切相關(guān),但有關(guān)星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)樹(shù)突棘的影響,人們了解很少。最近用雙光子成像技術(shù)的研究顯示,星形膠質(zhì)細(xì)胞突起的活動(dòng)與其鄰近樹(shù)突絲的運(yùn)動(dòng)密切相關(guān),星形膠質(zhì)細(xì)胞的突起通過(guò)直接接觸,具有穩(wěn)定樹(shù)突絲活動(dòng)和促進(jìn)樹(shù)突絲的發(fā)育的作用。但星形膠質(zhì)細(xì)胞是否可通過(guò)釋放信號(hào)分子來(lái)調(diào)節(jié)樹(shù)突絲形態(tài)和運(yùn)動(dòng)目前還不清楚。我們的研究目的是建立藍(lán)光刺激膠質(zhì)細(xì)胞(表達(dá)光敏感通道ChR2)對(duì)神經(jīng)元樹(shù)突絲形態(tài)及運(yùn)動(dòng)檢測(cè)的模型,實(shí)現(xiàn)選擇性激活星形膠質(zhì)細(xì)胞,研究星形膠質(zhì)細(xì)胞興奮對(duì)神經(jīng)元樹(shù)突絲運(yùn)動(dòng)的影響及其可能的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)方法：原代培養(yǎng)SD大鼠的星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞,并建立星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的混合培養(yǎng)模型。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將光敏感通道(Channelrhodopsin2)轉(zhuǎn)入原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中,當(dāng)Channelrhodopsin2在細(xì)胞膜表面表達(dá)后,用470mm藍(lán)色脈沖光(刺激模式為1Hz,800ms open,200ms closed,10次/串)照射星形膠質(zhì)細(xì)胞,并用激光共聚焦顯微鏡觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞的活動(dòng)(以鈣波為活動(dòng)信號(hào))。采用電轉(zhuǎn)方法將熒光蛋白GFP轉(zhuǎn)入神經(jīng)元細(xì)胞,并用激光共聚焦顯微鏡觀察第4-5天神經(jīng)元細(xì)胞樹(shù)突絲的形態(tài)和運(yùn)動(dòng),同時(shí)給予100μMATP或100μM谷氨酸,觀察ATP或谷氨酸對(duì)神經(jīng)元樹(shù)突絲的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)的影響。對(duì)混合培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞給予上述模式的光刺激,同樣激光共聚焦顯微鏡觀察混合培養(yǎng)的第4-5天的神經(jīng)元細(xì)胞樹(shù)突絲的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)。最后用Metamorph軟件對(duì)ATP、谷氨酸或光刺激混合培養(yǎng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元樹(shù)突絲形態(tài)和運(yùn)動(dòng)的影響做定量分析。 結(jié)果：1.Channelrhodopsin2可以穩(wěn)定表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞膜表面,并可維持一周左右的時(shí)間。我們對(duì)激活星形膠質(zhì)細(xì)胞的光刺激模式進(jìn)行摸索,發(fā)現(xiàn)模式為1Hz,800ms open,200ms closed,10次/串時(shí)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞有較好的激活作用。星形膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出不同程度的鈣波,大致分為四種情況：?jiǎn)未味虝r(shí)程鈣波,多次短時(shí)程鈣波,單次長(zhǎng)時(shí)程鈣波,多次即時(shí)鈣波。2.在單獨(dú)培養(yǎng)的情況下,100μM的ATP或100gM谷氨酸可以抑制處于體外培養(yǎng)第4-5天的神經(jīng)元樹(shù)突絲的運(yùn)動(dòng),給藥前后有顯著性差異。3.在混合培養(yǎng)的模型中,用光刺激器選擇性激活星形膠質(zhì)細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元樹(shù)突絲的運(yùn)動(dòng)同樣被抑制,定量分析顯示有顯著性差異。 結(jié)論：Channelrhodopsin2可以穩(wěn)定表達(dá)在星形膠質(zhì)細(xì)胞膜表面,運(yùn)用光刺激可以選擇性激活混合培養(yǎng)中的星形膠質(zhì)細(xì)胞。星形膠質(zhì)細(xì)胞的興奮可以抑制神經(jīng)元樹(shù)突絲的運(yùn)動(dòng),效果與100μMATP或100μM谷氨酸類似。這表明星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元樹(shù)突絲運(yùn)動(dòng)的抑制作用,很可能是通過(guò)ATP或谷氨酸等神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)節(jié)作用完成,該結(jié)論有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。
【圖文】：

圖1光刺激器LASER一WAvEn及光纖2.5激光共聚焦顯微鏡記錄星形膠質(zhì)細(xì)胞的鈣波及神經(jīng)元樹(shù)突絲的運(yùn)動(dòng)chRZ在星形膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)后，，用終濃度為5“M的RhodZ孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞，時(shí)間為3omin一4omin。激光共聚焦顯微鏡的激發(fā)光選擇488和cy3，物鏡為20/。選擇488通道可圈出轉(zhuǎn)入chRZ的星形膠質(zhì)細(xì)胞，然后選擇cy3通道進(jìn)行序列掃描(腸melapse)，參數(shù)為:Interval:3.osee;Number:500;腸talTime:25min;resolution:512‘512。所圈細(xì)胞紅色熒光的強(qiáng)弱變化即為星形膠質(zhì)細(xì)胞鈣波的振蕩變化。給第小5天純培養(yǎng)神經(jīng)元100”MATP或100抖M谷氨酸，觀察這兩個(gè)遞質(zhì)對(duì)神經(jīng)元樹(shù)突上fil叩edia運(yùn)動(dòng)的影響。對(duì)于混合培養(yǎng)的神經(jīng)元，同樣選擇第小5天這

圖2激光共聚焦顯微鏡IX71數(shù)據(jù)的采集和處理形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)鈣的測(cè)量，先通過(guò)Metamo甲h軟件分析得到圖片中熒光強(qiáng)度的大小，再通過(guò)Excel軟件分析計(jì)算可以得到胞內(nèi)鈣含量隨情況。Fifopodia運(yùn)動(dòng)能力的強(qiáng)弱以fil叩odia端點(diǎn)的運(yùn)動(dòng)速度來(lái)衡量，orph軟件可以得到每?jī)蓮垐D之間端點(diǎn)的移動(dòng)距離，再通過(guò)Excel計(jì)算速度。兩組數(shù)據(jù)間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異采用t一test。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R33

【共引文獻(xiàn)】

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2 柳浦青;竺可青;;星形膠質(zhì)細(xì)胞的興奮對(duì)神經(jīng)元樹(shù)突絲運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)機(jī)制[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2011年07期

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本文編號(hào)：2570226