【摘要】：目的： 隨著骨組織工程由基礎研究向臨床過渡,面臨著血管化的問題。目前構建的組織工程骨植入體內后血管生長速度不能滿足種子細胞營養(yǎng)和氧需要。本實驗將臍靜脈內皮細胞與骨髓間充質干細胞作為種子細胞,觀察體外共培養(yǎng)時兩種細胞的相互作用和功能影響,并通過構建組織工程顆粒骨模型,探討共培養(yǎng)在骨組織工程血管化研究中的應用。 方法： 1.用密度梯度離心法分離骨髓血中的HBMSCs,通過流式細胞術和多向分化能力對其進行鑒定。 2.膠原酶灌流消化法獲得HUVECs,觀察其生長增殖情況,通過免疫組織化學和流式細胞術對其進行鑒定。 3.將HBMSCs和HUVECs在體外1:1直接共培養(yǎng),Matrigel實驗觀察共培養(yǎng)對HUVECs體外血管形成能力的影響。將HBMSCs成骨誘導7d后,去除成骨誘導液,加入HUVECs,茜素紅染色觀察共培養(yǎng)對其成骨分化能力的影響。 4.將HBMSCs接種在珊瑚顆粒上,體外成骨誘導7天后,用HUVECs+藻酸鹽凝膠包裹植入裸鼠皮下,另設不加HUVECs的單純HBMSCs+珊瑚+藻酸鹽凝膠組和無細胞的單純珊瑚+藻酸鹽凝膠材料組,分別于1、2、4、6、8、10周取材,組織學染色觀察其成骨及成血管情況。 結果： 1.密度梯度離心法可分離出純度較高的HBMSCs,高表達間充質干細胞標志CD29、CD90,不表達造血干細胞標志CD34、CD45,能在體外穩(wěn)定擴增并保持多向分化能力。 2.膠原酶消化獲取的血管內皮細胞活性好,PECAM-1免疫組化染色陽性,高表達成熟內皮細胞表面標志CD31,低表達內皮祖細胞及造血干細胞表面標志CD34及血管粘附分子CD106。 3. HBMSCs與HUVECs體外直接共培養(yǎng)細胞相容性良好,Matrigel實驗顯示共培養(yǎng)組形成的毛細血管狀結構較單一細胞組多。成骨誘導的HBMSCs去除成骨誘導液后,共培養(yǎng)組茜素紅染色陽性,單一細胞組茜素紅染色陰性。 4.體內實驗結果顯示,共培養(yǎng)組和單純HBMSCs組成骨良好,隨著時間推移支架降解,骨小梁增多并逐漸成熟。但共培養(yǎng)組并未觀察到更明顯的血管化,與單純HBMSCs組之間的新骨形成情況無明顯區(qū)別。 結論： 通過密度梯度離心法可分離獲得純度較高的HBMSCs,經(jīng)體外培養(yǎng)能保持多向分化潛能；膠原酶消化法能獲得活性高的HUVECs。HBMSCs和HUVECs體外直接共培養(yǎng)時存在協(xié)同作用,HBMSCs能促進HUVECs形成毛細血管狀結構,而HUVECs能促進成骨誘導的HBMSCs的礦化形成能力。以HBMSCs為種子細胞構建的組織工程化骨顆粒在體內成骨良好,但本實驗中共培養(yǎng)的HUVECs在體內存活效率不高,共培養(yǎng)組沒有觀察到優(yōu)于單純細胞組的新生血管,可能是由于構建的支架材料和方法存在不足,需要進一步探索和研究尋求更適于共培養(yǎng)體系構建的支架和方法。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R329

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本文編號：2570210