【摘要】：目的： 隨著骨組織工程由基礎(chǔ)研究向臨床過渡,面臨著血管化的問題。目前構(gòu)建的組織工程骨植入體內(nèi)后血管生長速度不能滿足種子細(xì)胞營養(yǎng)和氧需要。本實驗將臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞,觀察體外共培養(yǎng)時兩種細(xì)胞的相互作用和功能影響,并通過構(gòu)建組織工程顆粒骨模型,探討共培養(yǎng)在骨組織工程血管化研究中的應(yīng)用。 方法： 1.用密度梯度離心法分離骨髓血中的HBMSCs,通過流式細(xì)胞術(shù)和多向分化能力對其進行鑒定。 2.膠原酶灌流消化法獲得HUVECs,觀察其生長增殖情況,通過免疫組織化學(xué)和流式細(xì)胞術(shù)對其進行鑒定。 3.將HBMSCs和HUVECs在體外1:1直接共培養(yǎng),Matrigel實驗觀察共培養(yǎng)對HUVECs體外血管形成能力的影響。將HBMSCs成骨誘導(dǎo)7d后,去除成骨誘導(dǎo)液,加入HUVECs,茜素紅染色觀察共培養(yǎng)對其成骨分化能力的影響。 4.將HBMSCs接種在珊瑚顆粒上,體外成骨誘導(dǎo)7天后,用HUVECs+藻酸鹽凝膠包裹植入裸鼠皮下,另設(shè)不加HUVECs的單純HBMSCs+珊瑚+藻酸鹽凝膠組和無細(xì)胞的單純珊瑚+藻酸鹽凝膠材料組,分別于1、2、4、6、8、10周取材,組織學(xué)染色觀察其成骨及成血管情況。 結(jié)果： 1.密度梯度離心法可分離出純度較高的HBMSCs,高表達間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志CD29、CD90,不表達造血干細(xì)胞標(biāo)志CD34、CD45,能在體外穩(wěn)定擴增并保持多向分化能力。 2.膠原酶消化獲取的血管內(nèi)皮細(xì)胞活性好,PECAM-1免疫組化染色陽性,高表達成熟內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志CD31,低表達內(nèi)皮祖細(xì)胞及造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD34及血管粘附分子CD106。 3. HBMSCs與HUVECs體外直接共培養(yǎng)細(xì)胞相容性良好,Matrigel實驗顯示共培養(yǎng)組形成的毛細(xì)血管狀結(jié)構(gòu)較單一細(xì)胞組多。成骨誘導(dǎo)的HBMSCs去除成骨誘導(dǎo)液后,共培養(yǎng)組茜素紅染色陽性,單一細(xì)胞組茜素紅染色陰性。 4.體內(nèi)實驗結(jié)果顯示,共培養(yǎng)組和單純HBMSCs組成骨良好,隨著時間推移支架降解,骨小梁增多并逐漸成熟。但共培養(yǎng)組并未觀察到更明顯的血管化,與單純HBMSCs組之間的新骨形成情況無明顯區(qū)別。 結(jié)論： 通過密度梯度離心法可分離獲得純度較高的HBMSCs,經(jīng)體外培養(yǎng)能保持多向分化潛能；膠原酶消化法能獲得活性高的HUVECs。HBMSCs和HUVECs體外直接共培養(yǎng)時存在協(xié)同作用,HBMSCs能促進HUVECs形成毛細(xì)血管狀結(jié)構(gòu),而HUVECs能促進成骨誘導(dǎo)的HBMSCs的礦化形成能力。以HBMSCs為種子細(xì)胞構(gòu)建的組織工程化骨顆粒在體內(nèi)成骨良好,但本實驗中共培養(yǎng)的HUVECs在體內(nèi)存活效率不高,共培養(yǎng)組沒有觀察到優(yōu)于單純細(xì)胞組的新生血管,可能是由于構(gòu)建的支架材料和方法存在不足,需要進一步探索和研究尋求更適于共培養(yǎng)體系構(gòu)建的支架和方法。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329

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本文編號：2570210