【摘要】：背景 1940年Levine和Stetson發(fā)現(xiàn)了Rh血型系統(tǒng),臨床研究證明該系統(tǒng)抗原抗體不匹配能引起溶血性輸血反應(yīng)、新生兒溶血病和自身免疫性溶血性貧血等疾病,其臨床重要性僅次于ABO血型系統(tǒng)。自1990年RHD基因和RHCE基因的cDNA被克隆后,從基因結(jié)構(gòu)與功能方面探索Rh血型系統(tǒng)的研究進(jìn)展迅猛。利用基因分型技術(shù)已檢測出的RH等位基因已超過180個(gè),其中RHD等位基因120多個(gè),RHCE等位基因60多個(gè)。國內(nèi)外研究表明RH基因存在豐富的人種和民族差異,特別是在東方人中存在復(fù)雜的遺傳背景差異,不僅RHH基因編碼區(qū)存在多態(tài)性,而且非編碼區(qū)也富有多態(tài)性。 RH基因非編碼區(qū)主要包括啟動(dòng)子區(qū)、內(nèi)含子區(qū)、側(cè)翼序列和間隔區(qū),這些區(qū)域?qū)HH基因的表達(dá)調(diào)控起著重要的作用,同時(shí),這些區(qū)域的DNA序列也存在豐富的多態(tài)性。RHD和RHCE基因之間的間隔區(qū)主要包含下游Rhesus盒和1個(gè)SMP1基因。SMP1基因又名TMEM50A(跨膜蛋白50A),該基因第7外顯子的3端非翻譯區(qū)與RHCE基因的第10外顯子部分重疊,在進(jìn)化中高度保守。從位置推測SMP1基因多態(tài)性與特殊RHH單體型緊密連鎖,該基因相關(guān)功能性突變可能與特殊單體RH的選擇壓力有關(guān)。當(dāng)前對RH基因的編碼區(qū)研究較多,對RH基因的非編碼區(qū)研究很少,而對RH基因間隔區(qū)中的SMP1基因研究就更少,對藏族SMPl基因的研究未見報(bào)道。 對中國漢族和藏族SMPl基因多態(tài)性的比較研究有助于深入了解RH基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和民族遺傳背景差異,探討RHH基因非編碼區(qū)在RH基因進(jìn)化、重組和突變中的作用機(jī)制,揭示RHD和RHCE基因多態(tài)性的遺傳背景差異。 目的 比較研究中國漢族、藏族RH基因間隔區(qū)重要元件—SMPl基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和多態(tài)性,建立SMPl基因特異性檢測方法,探討SMPl基因多態(tài)性在RH基因進(jìn)化、交換重組和突變中的作用機(jī)制,比較研究SMP1基因多態(tài)性的民族背景差異和意義。 方法 1.用Rh血型微柱凝膠分型卡和抗-D、抗-C、抗-c、抗-E、抗-e單克隆、多克隆抗血清常規(guī)檢測Rh抗原,RhD鹽水法陰性樣本用間接抗球蛋白試驗(yàn)確認(rèn)其為Rh抗原血清學(xué)陰性,用吸收放散試驗(yàn)檢測Del型。 2.參考GenBank中的RH基因序列(BN000065.1及NC_000001)和SMPl基因序列(NT_004610.19)設(shè)計(jì)引物,應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)分段擴(kuò)增SMPl基因,PCR產(chǎn)物純化后直接測序。 3.利用序列分析軟件DNAMAN5.2.9和REPEATMASKER WEB SERVER(http://ftp. genom e.Washington. edu/cgi-bin/RepeatMasker)分析.SMP1基因序列和結(jié)構(gòu)。 4.根據(jù)SMPl基因外顯子多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)序列特異性引物(sequence specific primer, SSP),應(yīng)用PCR-SSP方法檢測SMP1基因1351TC多態(tài)性。 結(jié)果 1.182例隨機(jī)非血緣關(guān)系廣東漢族樣本中共檢出6種Rh表型,分別為DCCee表型104例(57.1%),DCcEe表型52例(28.6%),DCcee表型11例(6.1%),DccEE表型9例(5.0%),DccEe表型5例(2.7%),dccee表型1例(0.5%)。 2.50例隨機(jī)非血緣關(guān)系西藏藏族樣本中共檢出5種Rh表型,分別為DCcEe表型27例(54.0%),DCCee表型14例(28.0%),DccEe4表例(8.0%),DccEE表型4例(8.0%),DCcee表型1例(2.0%),未檢測到RhD陰性樣本。 3.在Rh表型分布中,藏族與漢族比較存在差異。漢族DCCee表型(57.1%)頻率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于藏族(28.0%),二者相比有顯著性差異(X2=20.65,P0.05),而藏族DCcEe表型(54.0%)頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于漢族(28.6%),二者相比也有顯著性差異(X2=11.29,P0.05),其他表型分布二者之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 4.漢族和藏族SMPl基因全長為24066bp,由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成。第1-6內(nèi)含子長度分別為2017bp、2381bp、8553bp、1188bp、3818bp、和3807bp；第1～7外顯子長度分別為159bp、106bp、113bp、68bp、93bp、61bp和1702bp。 5.在SMP1基因序列中,共有A堿基6631bp(27.5%),T堿基7390bp(30.7%),C堿基5026bp(20.9%),G堿基5019bp(20.9%),并散布有3個(gè)A-T富含區(qū)和34個(gè)Alu序列(SINE/Alu)。 6.漢族和藏族SMPl基因第1、2、3、4、5、6外顯子未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn),但該基因第7外顯子存在1351TC和1726GA多態(tài)性。 7.1351TC多態(tài)性分析結(jié)果表明181例漢族RhD陽性樣本、2例漢族RhD陰性樣本,3例漢族弱D樣本中共有66個(gè)樣本同時(shí)存在T/C多態(tài)性,106個(gè)樣本僅有CC多態(tài)性,14個(gè)樣本僅有TT多態(tài)性。1351TC多態(tài)性分析結(jié)果表明50例藏族RhD陽性樣本和7例RhD陰性樣本中,共有32個(gè)樣本同時(shí)存在T/C多態(tài)性,14個(gè)樣本僅有CC多態(tài)性,11個(gè)樣本僅有TT多態(tài)性。 8.在1351TC多態(tài)性分布中,漢族和藏族RhD陽性樣本之間比較存在顯著性差異(P0.05) 結(jié)論 1.漢族和藏族Rh表型分布特點(diǎn)既有相同之處,又有各自的區(qū)域分布特點(diǎn)。 2.漢族和藏族SMP1基因結(jié)構(gòu)保守,第1-6外顯子無多態(tài)性位點(diǎn),僅第7外顯子存在1351TC和1726GA多態(tài)性。 3.本研究成功建立SMP1基因外顯子和1351TC多態(tài)性檢測方法,可用于中國人SMP1基因結(jié)構(gòu)研究。 4.漢族和藏族在1351TC多態(tài)性位點(diǎn)分布中存在顯著性差異。
【圖文】：

脂糖凝膠(含0.5陀/m1澳化乙錠)電泳，10風(fēng)PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣，以0.5XTBE為電泳緩沖液，電壓10Omv，電泳45min，凝膠成像，觀察結(jié)果。(2)翻護(hù)了基因第1、2、3、4、5、6和7外顯子，用1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5林g/ml嗅化乙錠)電泳，10此PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣，以0.5XTBE為電泳緩沖液，電壓100mV，，電泳，3Omin，凝膠成像，觀察結(jié)果。5.PCR產(chǎn)物分離、純化和測序RCR產(chǎn)物經(jīng)電泳法估計(jì)含量，濃度達(dá)到ZO0ng一400ng/此者送廣州工vitrogen生物技術(shù)有限公司分離、純化，運(yùn)用Rrimer一walking方法測序長片段〔38j。6.序列分析用DNAMANS.2.9和REPEAT撇SKERWEBSERVER(http://ftp.genome.washington.edu/Cgi一bin/RepeatMasker)在線序列分析軟件分析相關(guān)序列〔側(cè)。二、結(jié)果(一)翻滬l基因第1一6內(nèi)含子檢測結(jié)果8例樣本擴(kuò)增的人杖尸了基因第1一6內(nèi)含子分別在對應(yīng)位置出現(xiàn)特異條帶，圖1為1例DCCee表型漢族樣本醚爐了基因1~6內(nèi)含子檢測結(jié)果。

(三)邵滬1基因第3內(nèi)含子分段擴(kuò)增結(jié)果8例樣本擴(kuò)增的5腸O1基因第3內(nèi)含子分段擴(kuò)增片段在對應(yīng)位置分別出現(xiàn)特異條帶，圖3為1例DCCEe表型漢族樣本酬毋刁基因第3內(nèi)含子分段擴(kuò)增檢測結(jié)果。三二一20嘆)‘〕b】井10001，】，75Ob】聲5心〕Obl聲2501，】筍loob籠，圖3邵滬l基因第3內(nèi)含子分段擴(kuò)增電泳結(jié)果樣本為DCCEe表型漢族人樣本;M為 DNAmarker(四)S胭尸f基因第6內(nèi)含子nt84Obp至nt1020bp擴(kuò)增結(jié)果圖4為1例DCCEe表型漢族樣本嘆嬌�；虻�6內(nèi)含子nt84Obp至nt1O20bp擴(kuò)增檢測結(jié)果。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R394

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號：2568768