【摘要】：研究背景 干細胞移植修復損傷組織是當前研究的熱點。近年來,大量研究集中于解決如何對移植細胞進行示蹤觀察。磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging, MRI)可能是無創(chuàng)、在體示蹤細胞的最佳手段。眾多研究表明,在體外使用超順磁氧化鐵(Supraparamagnetic iron oxide, SPIO)標記干細胞后,借助MRI能無創(chuàng)、活體、實時、準確地對移植干細胞進行示蹤成像。SPIO微粒是一種惰性、生物相容性的可生物降解鐵。眾多研究表明,在一定濃度范圍內,SPIO標記對干細胞沒有毒性作用,SPIO標記干細胞后并不影響干細胞的活力、增殖力及分化潛能。不過,亦有研究發(fā)現(xiàn),SPIO標記影響干細胞向軟骨細胞或骨細胞分化。綜上所述,SPIO是否存在潛在的細胞毒性作用仍是一個未解決的問題,需進一步深入研究。 SPIO標記對細胞的直接作用是造成細胞內鐵超載。已有研究證實,SPIO標記后細胞內鐵濃度較正常增加數(shù)十至百倍。研究也表明SPIO標記對干細胞向軟骨細胞、骨細胞分化的影響與細胞內多余的游離鐵有關。所以,目前急需解決的問題是SPIO標記后細胞內鐵穩(wěn)態(tài)是否能夠維持。鐵調節(jié)蛋白／鐵反應元件系統(tǒng)(Iron Regulatory Proteins/Iron Responsive Elements System, IRPs/IREs系統(tǒng))是維持細胞內鐵穩(wěn)態(tài)最重要的鐵調節(jié)系統(tǒng)。它主要由轉鐵蛋白受體(Transferrin Receptor, TfR)、鐵蛋白(Ferritin, Fn)和鐵調節(jié)蛋白(Iron Regulatory Proteins, IRPs)構成,它們在鐵穩(wěn)態(tài)的維持中缺一不可。研究發(fā)現(xiàn),SPIO標記細胞后,細胞內Fn表達增加以儲存過多的鐵,而TfR表達下降以減少對細胞外鐵的攝取。不過,亦有研究發(fā)現(xiàn),SPIO標記后細胞內TfR表達增多。 TfR是細胞膜上的一種糖蛋白,其主要作用是與轉鐵蛋白結合介導細胞鐵吸收。當細胞內鐵缺乏時,TfR表達增多以使細胞外更多鐵進入細胞內；反之,TfR表達減少以阻止細胞外鐵進入細胞內。TfR高表達于不成熟紅細胞、胎盤組織、快速分裂細胞等中。 Fn是鐵的主要貯存形式,在鐵的儲存和釋放中起重要的作用。在哺乳動物體內,Fn含24個亞基,由鐵蛋白輕鏈(ferritin-L, FTL)和重鏈(ferritin-H, FTH)構成,且在不同組織中,兩者的構成比例不同。FTL和FTH在細胞鐵穩(wěn)態(tài)的維持中缺一不可,它們在鐵穩(wěn)態(tài)維持中執(zhí)行不同的功能,且兩者的功能不可替換。FTH具有亞鐵氧化酶活性,能催化二價鐵轉換成三價鐵,從而利于游離鐵進入鐵蛋白礦物中心。與此同時,FTH具有顯著的抗氧化活性,能減少細胞內活性氧化物的產(chǎn)生,從而阻止后者對細胞骨架的破壞。但是,Cozzi等發(fā)現(xiàn)FTH僅是一種鐵緩沖劑,其表達量維持在一定水平而不會出現(xiàn)過高表達或過低表達。與FTH不同,FTL不具有催化活性,但其表面含酸性基團,易于鐵的水解和礦化。肝細胞等富含鐵蛋白輕鏈的細胞具有很強的鐵儲存能力。最近研究也發(fā)現(xiàn),細胞內鐵濃度改變主要引起的是FTL表達量的改變,而FTH表達受影響不大。因此,了解SPIO標記干細胞內FTL和FTH表達情況對了解SPIO標記后干細胞內鐵穩(wěn)態(tài)是否能夠維持具有至關重要的意義。 干細胞治療的目的是將干細胞移植到特定的靶器官并分化成特定組織細胞,執(zhí)行相應的功能。有研究證實MRI示蹤觀察SPIO標記干細胞的時間可長達21天。研究也發(fā)現(xiàn)干細胞在誘導后2-3周已開始分化成相應的組織細胞并執(zhí)行部分功能。所以,有必要闡明SPIO標記干細胞經(jīng)誘導分化后,細胞內TfR、FTL和FTH表達的變化情況。 研究目的 1.探討轉染劑PLL介導SPIO標記大鼠ADSCs的可行性,及PLL介導SPIO標記對細胞活力、增殖力及向心肌樣細胞分化的影響。 2.探討SPIO標記對大鼠ADSCs及其心肌樣分化細胞內TfR、FTL及FTH表達的影響。 3.探討SPIO標記與TfR、FTL及FTH表達的劑量一效應關系。 材料與方法 1.大鼠ADSCs的分離、培養(yǎng) 無菌條件下切取3周齡雄性SD大鼠腹股溝處皮下脂肪組織,用PBS洗3-4遍后剪碎,并用0.25%Ⅱ型膠原酶消化30-45min,1500rpm離心10min,最后棄上清,用含10%胎牛血清的低糖DMEM重懸、接種,在飽和濕度、37℃、5%CO2的標準環(huán)境下培養(yǎng)。原代培養(yǎng)24小時后第一次換液,以后每三天換一次液,待貼壁細胞近鋪滿瓶底70-80%時,可進行傳代培養(yǎng)。 2.轉染劑PLL介導SPIO標記大鼠ADSCs,并檢測SPIO標記率、標記細胞活力和增殖能力 本實驗使用SPIO試劑為Resovist(Schering公司,德國),原始濃度28mg/ml。無血清培養(yǎng)基中加入SPIO和PLL,室溫下置于搖床搖晃混勻30分鐘,然后加入到P2代有貼壁干細胞且鋪滿瓶底近80%-90%的培養(yǎng)瓶內,再加入胎牛血清(終濃度10%)(SPIO終濃度分別為12.5-、25-、50-、75-、100-μg/mL,PLL/SPIO為1：0.03),在飽和濕度、37℃、5%CO2的標準環(huán)境下培養(yǎng)過夜(約12小時)。用普魯士藍染色定性檢測細胞內SPIO標記情況；用臺盼藍試驗檢測細胞活力；在標記后第1、3、5、7天用MTT試驗檢測細胞增殖能力,并繪制細胞生長曲線圖。 3. SPIO標記大鼠ADSCs向心肌樣細胞誘導分化 取P2代SPIO標記(終濃度35μg/ml)和未標記大鼠ADSCs,接種于六孔板中培養(yǎng)24小時后,每個孔內加入5-氮胞苷(終濃度為9gg/m1),置于飽和濕度、37℃、5%CO2標準環(huán)境下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。然后倒去細胞內培養(yǎng)液,用低糖DMEM+10%FBS的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至第2周,用免疫組化試驗檢測細胞內橫紋肌a-輔肌動蛋白、肌鈣蛋白T和I(cTnT、cTnI)的表達情況。 4.PLL介導SPIO標記對大鼠ADSCs及其心肌樣分化細胞內TfR、FTH和FTL表達的影響 本研究使用PLL介導SPIO標記P2代大鼠ADSCs(SPIO終濃度分別為12.5-、25-、50-、75-、100-μg/mL,PLL/SPIO=1:0.03)。在標記后第24小時、7天、21天用Trizol法提取細胞總RNA并用Lysis-M Reagent提取細胞總蛋白。同時設立對照組,即未標記大鼠ADSCs (SPIO終濃度為0μg/mL),將P2代ADSCs分別培養(yǎng)至第24小時、7天及21天后,用相同方法提取細胞內總RNA和總蛋白。然后分別用RT-PCR技術和Western blot技術檢測標記細胞及未標記細胞內TfR、FTL和FTH基因和蛋白表達情況。 本研究用5-氮胞苷處理SPIO標記(SPIO標記終濃度為35μg/m1)和未標記的大鼠ADSCs.將實驗分為四組,即標記未誘導組、未標記未誘導組、標記誘導組和未標記誘導組,分別在施加處理因素(SPIO標記和5-氮胞苷處理)后第7、14和21用Trizol法提取細胞總RNA并用Lysis-M Reagent提取細胞總蛋白,然后分別用RT-PCR技術和Western blot技術檢測四組細胞內TfR、FTL和FTH基因和蛋白表達情況。 5.統(tǒng)計學方法 使用SPSS13.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,所有計量資料均以x±s表示。P0.05時,認為差異有統(tǒng)計學意義。細胞增殖力及FTL、FTH、TfR基因和蛋白表達水平各時間點的比較采用重復測量方差分析；相同時間點,各組之間比較采用單向方差分析并進行兩兩比較；同一組不同時間點比較采用只有時間點的重復測量方差分析；各濃度組細胞活力比較采用單向方差分析并進行Dunnett兩兩比較。標記誘導組和未標記誘導組心肌細胞標志物cTnT、cTnI及橫紋肌α-肌動蛋白陽性率比較采用兩獨立樣本t檢驗。 結果 1.使用0.25%Ⅱ型膠原酶消化大鼠脂肪組織,并經(jīng)多次換液、傳代后,能夠在體外成功分離培養(yǎng)出大鼠ADSCs。在原代培養(yǎng)24小時后即可看到貼壁細胞,細胞呈多種形態(tài),以后經(jīng)過多次換液、傳代,細胞數(shù)量明顯增多,呈典型的成纖維細胞樣長梭形外觀,且細胞形態(tài)較均一、排列有一定方向性。在原代培養(yǎng)6-7天后即可進行第一次傳代,以后約3-4天可傳代一次,傳10代后細胞形態(tài)及生長速度仍無明顯改變。 2.轉染劑PLL介導SPIO能簡單、高效的標記大鼠ADSCs。當SPIO標記終濃度為12.5μg/ml,細胞SPIO標記率為76.6%4±0.45%,尚有部分細胞未被標記；當SPIO標記終濃度為25gg/ml-100μg/ml時,細胞SPIO標記率達到近100%,且隨著SPIO標記終濃度的增加,細胞內藍色陽性反應區(qū)增大、增多。經(jīng)臺盼藍試驗檢測,各濃度SPIO標記組及未標記組之間細胞活力差異無統(tǒng)計學意義(F=0.559,P=0.730)。經(jīng)重復測量方差分析,各濃度SPIO處理與時間間存在交互效應(F=8.587,P=0.000),各濃度SPIO標記組和未標記組組間各時間點細胞增殖能力差異有統(tǒng)計學意義(F=48.246,P=0.000),不同時間點間細胞增殖能力差異有統(tǒng)計學意義(F=3226.026,P=0.000)。 3.SPIO標記不影響大鼠ADSCs向心肌樣細胞分化。經(jīng)兩獨立樣本t檢驗,SPIO標記組細胞與未標記組細胞相比,細胞內cTnT、cTnI及橫紋肌α-輔肌動蛋白陽性率差異沒有統(tǒng)計學意義(t=0.304、1.011、0.263,P=0.779、0.369、0.807)。4.轉染劑PLL介導SPIO標記大鼠ADSCs后,細胞內FTL基因和蛋白、FTH基因表達水平會暫時性升高,TfR基因和蛋白表達水平會暫時性降低。經(jīng)重復測量方差分析,各濃度SPIO處理與時間間FTH mRNA表達水平不存在交互效應(F=2.027,P=0.059),各濃度SPIO處理與時間間FTL、TfR基因和蛋白表達水平存在交互效應(F=3.055、26.903、7.573、64.16],P=0.003、0.012、0.000、0.000)。各濃度SPIO標記組與未標記組組間FTL基因和蛋白、FTH基因、TfR基因和蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義(F=246.725、279.895、55.668、169.487、261.018,P=0.000、0.000、0.000、0.000、0.000)；不同時間之間細胞內FTL、TfR基因和蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義(F=41.170、86.800、26.950、368.709,P=0.000、0.000、0.000、0.000),FTH基因表達水平差異沒有統(tǒng)計學意義(F=3.218,P=0.052)。與未標記組細胞相比,各濃度SPIO標記組FTL、TfR基因和蛋白表達水平差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。SPIO標記可使細胞內FTL、FTH表達量增多,TfR表達水平降低,且SPIO標記濃度越高,FTL、FTH表達水平越高,但當SPIO濃度達到50gg/ml及以上時,FTH基因表達維持在一定的水平。 我們將細胞分為四組,即標記未誘導組、未標記未誘導組、標記誘導組及未標記誘導組。經(jīng)重復測量方差分析,各處理組與時間間FTL基因和蛋白、FTH基因、TfR基因和蛋白表達水平存在交互效應(F=8.033、26.557、12.730、3.565、73.522,P=0.000、0.000、0.000、0.006、0.000)；四組細胞間FTL基因和蛋白、FTH基因、TfR基因和蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義(F=61.495、52.743、39.994、137.667、124.594,P=0.000、0.000、0.000、0.000、0.000)；不同時間之間細胞內FTL基因和蛋白、FTH基因、TfR蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義(F=23.537、79.876、21.603、282.941,P=0.000、0.000、0.000、0.000),TfR基因表達水平差異沒有統(tǒng)計學意義(F=0.036,P=0.965)。結合多重比較,標記未誘導組與標記誘導組細胞FTL和FTH基因和蛋白表達水平均高于未標記未誘導組和未標記誘導組,標記未誘導組與標記誘導組細胞TfR基因和蛋白表達水平均低于未標記未誘導組和未標記誘導組；誘導因素(5-氮胞苷)處理后第7、14、21天,細胞內FTL基因和蛋白、TfR基因和蛋白表達水平無明顯變化(P0.05)。 結論 從大鼠脂肪組織中可成功分離出干細胞。提取的干細胞不但具有間充質干細胞的形態(tài),且具有分離培養(yǎng)簡便、體外增殖能力強、生物學特征較穩(wěn)定等特點。運用轉染劑PLL介導SPIO可以簡單、高效的標記大鼠ADSCs, SPIO標記后會抑制干細胞增殖,但對細胞活力及向心肌細胞分化能力無明顯影響。 大鼠脂肪干細胞高表達FTL。在一定濃度范圍內,PLL介導SPIO標記可引起大鼠ADSCs內FTL、 FTH表達暫時性增多而TfR表達水平暫時性降低。當SPIO標記濃度達到50μg/ml及以上時,隨著SPIO標記濃度的增加,FTL表達量增多,而FTH表達維持在一定水平。所以我們推測,用25μg/ml-50μg/ml的SPIO標記大鼠ADSCs最佳,此時,細胞SPIO標記率達到100%,且細胞內FTH、FTL及TfR表達均會引起相應改變以維持細胞內鐵平衡。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R329

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本文編號：2564702