發(fā)布時間：2019-11-22 16:09

【摘要】：阿特拉津,又稱莠去津,是一種在全球范圍內廣泛使用的三嗪類除草劑。其在土壤和水體中的殘留會影響人體健康并對全球生態(tài)環(huán)境造成危害。因此,對環(huán)境中阿特拉津的殘留量進行實時監(jiān)測和評估分析,有助于防范和應對阿特拉津所來的負面影響。 目前對阿特拉津暴露風險監(jiān)測和評估的方法主要是基于大型儀器,而這些方法相對耗時,且成本較高。基于免疫學抗原-抗體反應的快速檢測阿特拉津殘留方法則更高效、方便且經濟。但免疫學方法檢測的關鍵是要獲得特異性強、親和力高的抗體。 噬菌體展示抗體庫技術(Phage Display Antibody Library technology)由于能繞過雜交瘤技術或動物免疫,而成為是迄今為止發(fā)展最成熟、應用最廣泛的基因工程抗體制備技術之一。免疫抗體庫是指采用經過免疫后的淋巴細胞構建的抗體庫。由于用于構建抗體庫的淋巴細胞已經在體內經過抗原選擇和親和力成熟,因此從庫容較小(105-106)的免疫庫中就可以篩選到特異性強、親和力高的抗體。 本實驗利用阿特拉津免疫Balb/c小鼠脾臟為抗體庫基因來源構建噬菌體scFv抗體庫,并用直接包被(固相)和磁珠(半固相)方法分別對scFv抗體庫進行了篩選。 主要研究內容和結果分述如下： 1噬菌體展示免疫抗體庫的構建 以提取的阿特拉津免疫小鼠脾臟總RNA為模板,經M-MLV逆轉錄酶反轉mRNA成cDNA后,PCR擴增出重鏈可變區(qū)基因(VH)和輕鏈可變區(qū)基因(VL),SOE-PCR技術連接VH、VL和GS-linker成scFv。并將scFv與T7Select(?)10-3b載體連接,經體外包裝成熟后感染宿主BLT5403擴增,得到了庫容量為1.0×105,滴度為2.0×1011的抗體庫。 2直接包被篩選阿特拉津特異抗體 利用硅烷法對酶標板表面進行氨基化修飾,并利用活性酯法將羥基化的阿特拉津偶聯在酶標板上。通過對抗體庫進行3輪的“孵育-洗脫-擴增”直接包被固相篩選。特異性噬菌體富集了185倍。從第三輪篩選的洗脫滴度平板中隨機挑取了16株噬菌體,經PCR驗證共有9株噬菌體展示有scFv抗體。經測序發(fā)現有3株噬菌體所展示的scFv相同。另外隨機挑取了3株噬菌體,構建pTIG-Trx-scFv表達載體。經IPTG誘導表達和純化后,對得到的scFv抗體進行了ELISA和間接競爭ELISA測定,最終得到一株針對阿特拉津的特異性抗體。 3磁珠法篩選阿特拉津特異抗體 利用活性酯法將羧基化的阿特拉津與氨基化的磁珠偶聯,對抗體庫進行了4輪半固相篩選。特異性噬菌體富集了369倍。隨機從第四輪篩選的洗脫滴度平板中挑取47株噬菌體,通過噬菌體ELISA和間接競爭ELISA對噬菌體表面展示的抗體進行了親和力和特異性驗證,得到了一株對阿特拉津有特異性的噬菌體。PCR擴增抗體基因后構建表達載體,對抗體進行了表達和純化,并對純化后的抗體的結合和競爭活性進行了鑒定。
【圖文】：

所抑制(smith，1985)。這是第一次對的噬菌體展示(ph技術的基本原理術是將外源將蛋白或膚段的基因克隆到噬菌體基因組面表達并展示。其主要特點是將特定分子的基因型與在噬菌體表面表達特定蛋白，，而在噬菌體核心中則含示在噬菌體表面的蛋白或多膚進行親和篩選，另外噬到擴增，該技術又將選擇能力和擴增能力聯系到一起，從數量眾多的多樣化噬菌體群體中選擇出能特異結合染大腸桿菌使選擇出的噬菌體得到擴增和富集，如圖冬生弓盛感~

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【學位授予單位】：華中農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關期刊論文 前6條

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相關碩士學位論文 前1條

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本文編號：2564548