【摘要】：中文摘要 背景(background):鉤端螺旋體(簡稱鉤體)分為致病性鉤體和非致病性鉤體兩大類。非致病性鉤端螺旋體存在于潮濕土壤和地表水中,屬于腐生性愿核細胞型微生物,不引起人或動物疾病。致病性鉤體中目前至少確定有7種基因種,如Leptospira interrogans、Leptospira borgpetersenii、Leptospira kirschneri和Leptospira weilii等,其中問號鉤體(L. interrogans)是流行最廣的致病性鉤體。由致病性鉤體感染引起的鉤體病是全球流行的人畜共患傳染病,好發(fā)于熱帶或亞熱帶國家或地區(qū),我國也是鉤體病主要疫區(qū)之一。致病性鉤體有強大的侵襲力,能迅速通過皮膚或黏膜侵入血流,引起中毒性敗血癥癥狀,如高熱、頭痛、肌痛等,鉤體隨血流侵入肺、肝、腎等臟器,引起肺出血、黃疸和腎功能損傷,常因呼吸或腎功能衰竭而導致死亡,其中肺彌漫性出血鉤體病死亡率高達50%以上。鼠類和家畜是鉤體主要動物宿主,感染鉤體后雖無明顯癥狀,但可長期甚至終身從尿液排出鉤體,污染土壤或水系成為疫源地。然而,鉤體不產(chǎn)生任何典型的外毒素,其脂多糖(LPS)毒性僅為大腸桿菌LPS的1/10～1/100,故鉤體毒力因子及其致病機制至今所知甚少。細菌膠原酶可以有效降解宿主結(jié)締組織及胞外基質(zhì)(extracellular matrix)中的膠原蛋白,是不少病原菌重要的侵襲性毒力因子之一。在問號鉤體黃疸出血群賴型賴株基因組中,含有一個膠原酶編碼基因(colA).如前所述,致病性鉤體有強大的侵襲力,但至今未見致病性鉤體膠原酶功能及其致病性的研究報道。 目的(aim)：了解鉤體膠原酶水解不同膠原蛋白底物能力及特異性、最佳工作pH和金屬離子濃度等酶動力學特征,采用問號鉤體黃疸出血群賴型賴株膠原酶基因敲除突變株(colA)金地鼠感染模型,采用基因敲除技術(shù)了解鉤體膠原酶基因?qū)鸬厥蠖玖Α⒎魏透渭澳I組織中鉤體載量及組織病變的影響,闡明鉤體膠原酶工作機制及其致病意義。 方法(methods):以我國流行最廣的問號鉤體黃疸出血群賴型賴株基因組DNA為模板,采用高保真PCR擴增全長colA基因,T-A克隆后測序。以pET42a為表達載體、E.coli BL21DE3為表達宿主菌,構(gòu)建膠原酶原核表達系統(tǒng)E.coli BL21DE3pET42a-colA采用0.5mM IPTG28℃誘導E.coli BL21DE3pET42a-colA表達重組ColA蛋白(rColA)、Ni-NTA親和層析柱提純rColA,采用SDS-PAGE及Bio-Rad凝膠圖象分析系統(tǒng)檢查rColA表達情況及提純效果。采用多種膠原酶蛋白底物(多種膠原蛋白、Azocoll和Pz-肽)、不同pH和金屬離子及濃度緩沖液,了解鉤體重組膠原酶最佳膠原蛋白底物、pH和金屬離子及其濃度等酶動力學特征。采用實時熒光定量RT-PCR及Western Blot檢測感染問號鉤體黃疸出血群賴型賴株感染人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)或人腎上皮細胞(HEK293)后colA基因表達水平變化及分泌情況。采用基于自殺質(zhì)粒的基因敲除技術(shù),構(gòu)建問號鉤體黃疸出血群賴型賴株膠原酶基因敲除突變株(colA-)。將不同濃度colA-突變株或野生株腹腔注射攻擊鉤體敏感動物金地鼠,了解colA-突變株或野生株對金地鼠毒力差異(LD50)。采集colA-突變株與野生株感染金地鼠的肺、肝、腎組織標本,固定、包埋、切片后分別HE和銀染色,觀察各組織標本中鉤體載量及組織病變的差異。 結(jié)果(results):我們克隆的鉤體colA基因序列與GenBank中公布的問號鉤體黃疸出血群賴型賴株鉤體colA基因序列有很高的相似性。所構(gòu)建的鉤體colA基因原核表達系統(tǒng)E.coli BL21DE3pET42a-colA能有效表達目的重組蛋白rColA, Ni-NTA親和層析柱純化的rColA經(jīng)SDS-PAGE后在凝膠中顯示為單一的蛋白條帶。rColA在37℃、pH7.4、0.4mM CaCl2-50mM Tris-HCl緩沖液中有最佳水解底物的效果,盡管rColA能在不同程度上水解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白及Azocoll、Pz-肽廣泛的底物特異性,但最佳水解底物為Ⅲ型膠原蛋白。Western Blot檢測結(jié)果顯示,問號鉤體黃疸出血群賴型賴株EMJH培養(yǎng)物上清中未檢出ColA蛋白,但感染人臍靜脈細胞(HUVEC)和人腎上皮細胞(HEK293)后colA-mRNA水平迅速升高并在感染細胞后6h達到峰值,問號鉤體黃疸出血群賴型賴株與HUVEC或HEK293細胞共培養(yǎng)物上清中可檢出ColA蛋白。問號鉤體賴株colA-突變株及野生株對金地鼠的LD50分別約為108和106。colA-突變株感染的金地鼠肺、肝、腎組織中鉤體載量明顯低于野生株,肺、肝、腎組織病變也明顯輕于野生株。 結(jié)論(conclusion):問號鉤體黃疸出血群賴型賴株colA基因表達產(chǎn)物ColA是一種膠原酶,對不同膠原酶底物具有廣泛但不同程度的水解活性,但其最佳水解底物為Ⅲ型膠原蛋白。問號鉤體賴株在體外培養(yǎng)基中不分泌ColA蛋白,但感染宿主細胞后ColA蛋白表達水平顯著升高并可外分泌。colA基因敲除的問號鉤體賴株對金地鼠毒力明顯減弱,肺、肝和腎組織中鉤體載量顯著減少,組織病變程度也顯著下降。綜上所述,膠原酶ColA是在問號鉤體致病過程中發(fā)揮重要作用的毒力因子。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R377

【參考文獻】

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1 ;Expression and Comparative Analysis of Genes Encoding Outer Membrane Proteins LipL21,LipL32 and OmpL1 in Epidemic Leptospires[J];Acta Biochimica et Biophysica Sinica;2005年10期

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本文編號：2564822