【摘要】：牛乳是引起食物過(guò)敏的八大類(lèi)常見(jiàn)食物之一。據(jù)報(bào)道,牛乳過(guò)敏引發(fā)的病癥在嬰幼兒中尤為常見(jiàn),1歲以下嬰幼兒中的發(fā)生率約為2-3%。因此,開(kāi)展牛乳過(guò)敏的研究對(duì)于提高牛乳過(guò)敏人群生活質(zhì)量具有重要的的現(xiàn)實(shí)意義。另外,由于表位是食物過(guò)敏反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ),所以表位定位是牛乳過(guò)敏研究的一個(gè)核心問(wèn)題,也是人們認(rèn)識(shí)食物過(guò)敏的首要任務(wù)。 本文以過(guò)敏原蛋白質(zhì)β-酪蛋白為研究對(duì)象,從鮮牛乳中分離純化β-酪蛋白、制備特異性多克隆抗體、親和純化多克隆抗體、建立β-酪蛋白構(gòu)象模型、最終定位出β-酪蛋白的構(gòu)象性表位,主要的研究工作和結(jié)論如下。 1.采用等電點(diǎn)沉淀法從鮮牛乳中得到酪蛋白,冷凍干燥后的酪蛋白粉末經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱分離后,得到了β-酪蛋白。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳和等電聚焦電泳鑒定,結(jié)果表明,獲得了純度高于90%的β-酪蛋白。 2.采用分離純化的β-酪蛋白免疫日本大白耳兔,制備兔抗牛乳β-酪蛋白多克隆抗體,免疫過(guò)程中利用間接ELISA方法監(jiān)測(cè)免疫效價(jià)的變化,最終得到效價(jià)分別為1：240,000和1：150,000的抗血清各一份。 3.利用溴化氰活化的Sepharose4B對(duì)抗8-酪蛋白兔血清進(jìn)行親和純化,經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè),結(jié)果顯示純化后抗體在泳道中基本上只顯示出重鏈(55Kda)和輕鏈(22Kda)2條帶,純化效果較好；同時(shí)對(duì)純化后抗體進(jìn)行間接ELISA效價(jià)測(cè)定,A、B兩兔的血清效價(jià)分別從親和純化上樣前的100,000和70,000上升到純化后的120,000和80,000,表明經(jīng)過(guò)親和純化,得到了高純度和高特異性的多克隆抗體。 4.分別利用同源建模、折疊識(shí)別法建模、從頭預(yù)測(cè)方法對(duì)β-酪蛋白結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行構(gòu)建,并對(duì)所建模型進(jìn)行逐級(jí)開(kāi)放式優(yōu)化和Ramanchandran plot、WHAT_CHECK、ERRAT等方法評(píng)估,選擇最優(yōu)模型,結(jié)果得到經(jīng)同源建模并經(jīng)過(guò)優(yōu)化后的模型為最終的β-酪蛋白結(jié)構(gòu)模型；以文獻(xiàn)報(bào)道的針對(duì)β-酪蛋白空間構(gòu)象的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作為參照,將所建模型與Kumosinski等人的p-酪蛋白典型模型進(jìn)行比較,評(píng)價(jià)本研究工作中建模結(jié)果的準(zhǔn)確性,結(jié)果顯示,與Kumosinski等人所建模型相比,本實(shí)驗(yàn)所建模型更能與β-酪蛋白空間構(gòu)象的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)吻合。 5.通過(guò)噬菌體肽庫(kù)篩選得到了用于β-酪蛋白構(gòu)象性表位定位的6個(gè)模擬肽；同時(shí)通過(guò)搜索得到晶體結(jié)構(gòu)已解析的抗原抗體的復(fù)合物,并提取其中的表位信息,形成數(shù)據(jù)信息庫(kù),然后對(duì)該庫(kù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,得到表位覆蓋面積大小、表位氨基酸數(shù)目、不同種類(lèi)表位氨基酸殘基的出現(xiàn)頻率、表位中起間隔作用的氨基酸殘基類(lèi)型和出現(xiàn)頻率以及表位氨基酸殘基在不同蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)頻率等信息；所得信息結(jié)合噬菌體肽庫(kù)篩選結(jié)果,最終定位出β-酪蛋白的4個(gè)構(gòu)象性表位。
【圖文】：

收集圖2.1中的各洗脫峰進(jìn)行電泳鑒定，在SDS一PAGE電泳的結(jié)果中與蛋白質(zhì)Maker的比對(duì)得到所得蛋白質(zhì)的分子量，，根據(jù)條帶定性得到蛋白質(zhì)的純度。粗蛋白和圖2.1中a、b、c、d峰對(duì)應(yīng)圖2.2中的e、a、 MeabCb、c、d五條泳道。d嘉涵藏疾奔娜贏澎舔諳滬叮、泛舞辮牽_ Da9570307255嚼輸秘娜癡43翩枷娜終水娜·馨鑫典:嘴耀髦澎熱癱娜渺娜一圖2.2離子交換層析各峰樣品SDS一隊(duì)GE電泳圖M低分子量蛋白marker，e:酪蛋白全蛋白;a:圖2.1中峰a;b:峰b;。:峰c;d:峰d; Figure2.2SDS一 PAGEelectroPhoretiePatternsofthePeakseolleetedduringion一exehangeehromatograhPy由圖可以看出，b峰和c峰所對(duì)應(yīng)的SDS一PAGE條帶純度較高，分子量與p一酪蛋白相吻合，但是c峰電泳條帶顯示純度比b峰略低，而且上樣過(guò)程中只是收集峰頂位置進(jìn)行檢測(cè)，c峰與d峰沒(méi)有很好的分離，因此收集圖2.1和2.2中所示的純度較高、分離純度較好的b峰進(jìn)行下一步的IEF一隊(duì)GE鑒定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)

收集峰頂位置進(jìn)行檢測(cè)，c峰與d峰沒(méi)有很好的分離，因此收集圖2.1和2.2中所示的純度較高、分離純度較好的b峰進(jìn)行下一步的IEF一隊(duì)GE鑒定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，所得圖譜如圖2.3所示，根據(jù)離子交換層析、SDS一隊(duì)GE和等電聚焦圖譜
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 黃艷新;鮑永利;李玉新;;抗原表位預(yù)測(cè)的免疫信息學(xué)方法研究進(jìn)展[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2008年09期

本文編號(hào)：2557458