【摘要】：目的和意義 移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）治療缺血性心肌病已成為一大熱點。研究表明肌特異性miR-1在調(diào)控細(xì)胞肌分化方面起著關(guān)鍵作用。Notch信號通路參與調(diào)控眾多細(xì)胞生命過程，包括細(xì)胞增殖、凋亡和分化。有報道Notch信號通路與miRNAs之間相互作用，miRNAs調(diào)控Notch信號通路發(fā)揮生物學(xué)作用。基于此，我們假設(shè)轉(zhuǎn)導(dǎo)miR-1至大鼠MSCs內(nèi)并調(diào)控Notch信號通路來促進MSCs分化為心肌樣細(xì)胞，為缺血性心肌病的細(xì)胞治療提供可能。 方法 采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法從大鼠骨髓中獲得MSCs并觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞學(xué)鑒定MSCs；同時合成攜帶GFP過表達miR-1慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（MSCs~(miR-1)），對照組只攜帶GFP；將過表達miR-1慢病毒系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)大鼠MSCs并培養(yǎng)15天,光鏡下觀察轉(zhuǎn)導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)變化；在第0、4、6、15天qRT-PCR檢測miR-1、心肌相關(guān)基因GATA-4、α-actin、cTnI和Connexin43(Cx43)及Notch信號通路相關(guān)基因mRNA的表達變化；免疫熒光觀察cTnI和Cx43的表達；Western blotting檢測α-actin的蛋白表達。 結(jié)果 原代細(xì)胞呈長梭形、漩渦狀生長，流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果顯示98%以上細(xì)胞表達CD44和CD29，1%以下表達CD45；與對照組相比，MSCs~(miR-1)組的miR-1的含量明顯增高；轉(zhuǎn)導(dǎo)miR-1后，MSCs~(miR-1)組高表達心肌相關(guān)基因：包括GATA-4、α-actin、cTnI和Cx43；轉(zhuǎn)染4天后免疫熒光即可檢測cTnI和Cx43在MSCs~(miR-1)組的一些細(xì)胞中表達，并在第15天時表達最強；Western blotting更進一步證實了α-actin在MSCs~(miR-1)組中的表達。觀察轉(zhuǎn)導(dǎo)前后Notch信號通路基因的mRNA水平變化發(fā)現(xiàn)，miR-1通過調(diào)控配體Jagged1來促進分化；Jagged1的mRNA水平下調(diào)負(fù)性調(diào)控MSCs的肌細(xì)胞分化過程，同時我們觀察到了Notch1、Notch3和Hey2的mRNA水平下調(diào)，這說明，miR-1促進的肌分化過程伴隨著Notch信號通路的Jagged1-Notch1/Notch3-Hey2mRNA水平的顯著下調(diào)Jagged1-Notch1/Notch3-Hey2是肌分化過程中Notch信號通路的關(guān)鍵因子，這也許可以用來調(diào)控干細(xì)胞命運。 結(jié)論 轉(zhuǎn)導(dǎo)miR-1至大鼠MSCs中可促使其向心肌樣細(xì)胞的分化并伴隨下調(diào)Notch信號通路Jagged1-Notch1/Notch3-Hey2的mRNA水平。
【圖文】：

第 3 章 結(jié)果3.1 大鼠 MSCs 生長特點全骨髓貼壁培養(yǎng)法提取大鼠原代MSCs，顯微鏡下觀察細(xì)胞24h便開始貼壁，細(xì)胞形態(tài)均一，，呈梭形或多角形。48h 后首次換液去除未貼壁細(xì)胞，3 到 4 天后可見放射狀排列的細(xì)胞集落，伸出長短不一、粗細(xì)不均的突起，梭形細(xì)胞為主，細(xì)胞核明顯，核漿比例大（圖 1 左）。5 天左右細(xì)胞集落生長范圍擴大，融合80-90%，經(jīng)胰酶消化以 1:2 傳代，傳代后 8h 即可貼壁、3 天后即可 80%鋪滿瓶底,漩渦狀明顯，同向排列（圖 1 右）。

3.3.1 線性化載體構(gòu)建EcoR I酶切化學(xué)合成的含有目的基因的質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳顯示在289bp位置有條帶，與目的基因?qū)嶋H片段大小相符（圖3左）。同樣，使用EcoR I對載體質(zhì)粒進行酶切消化，因從細(xì)菌中提取的質(zhì)粒可能存在超螺旋，開環(huán)，線性等不同的構(gòu)象而具有不同的遷移速率，在瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)大小不同的條帶，質(zhì)粒經(jīng)單酶切消化后，在目標(biāo)位置呈現(xiàn)出均一的電泳條帶，顯示載體線性化成功（圖3右）。Quadrant StatiFile: 2011-7-7.002 Log Data Units: Linear ValueSample ID: Patient ID:Tube: Panel:Acquisition Date: 07-Jul-11 Gate: G1Gated Events: 9987 Total Events: 10998X Parameter: FL1-H CD45-FITC Y Parameter: FL3-H CD29-PQuad Location: 14, 18Qua Events% Gate% Tot X Mea X Geo MeY Mea Y Geo MeUL 988 99.0 89.9 4.11 3.771046.5 898.7UR 98 0.98 0.89 62.4 26.6 1479.5 1213.6LL 2 0.02 0.02 4.41 4.20 13.6 13.4LR 0 0.00 0.00 *** *** *** ***R1Histogram StaMark Left, Rig Event % Gat % Tot MeanGeo Me CV MediaPeak CAl 1, 99 987 100.0 82.0 31.2 27.2 58.5 27.3 28M1 1
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R363

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本文編號：2557369