【摘要】：第一部分白色念珠菌對巨噬細(xì)胞U937的活化作用 實驗?zāi)康模河^察白色念珠菌對人巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞的活化作用。 方法：觀察不同濃度不同作用時間點的白色念珠菌刺激人巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞后細(xì)胞培養(yǎng)液中NO濃度和Galectin-3的表達(dá)以及對細(xì)胞存活率的影響。 結(jié)果：1、白色念珠菌終濃度與巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞存活率與因子表達(dá)：在107PFU/mL及以下時,,促進(jìn)細(xì)胞生長,相對存活率升高,細(xì)胞中NO及Galectin-3的表達(dá)增強(qiáng),各組間比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；在108PFU/mL及以上時,可抑制細(xì)胞生長,相對存活率降低,細(xì)胞中NO及Galectin-3的表達(dá)降低,各組間比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05) 2、白色念珠菌作用時間與巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞存活率與因子表達(dá)：白色念珠菌處理3h及以上時,可促進(jìn)細(xì)胞生長,細(xì)胞中NO及Galectin-3的表達(dá)增強(qiáng),各組間比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；白色念珠菌處理3h及以下時,對細(xì)胞生長影響不大,細(xì)胞中NO及Galectin-3的表達(dá)變化不明顯,組別之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論：1、白色念珠菌濃度在107PFU/mL及以下時,刺激人巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞活化。對NO濃度和Galectin-3的表達(dá)以及對細(xì)胞存活率的影響呈正相關(guān)。 2、白色念珠菌作用時間3h及以上時人巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞活化。 第二部分半乳糖凝集素-3在白色念珠菌誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞中的表達(dá)及其功能 目的：觀察Galectin-3在白色念珠菌誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞中的表達(dá)并探討其功能。 研究方法：通過慢病毒載體介導(dǎo)的Galectin-3-shRNA沉默基因,建立半乳糖凝集素-3基因阻斷的人U937巨噬細(xì)胞株模型,體外評價和觀察galectin-3在人巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞受白色念珠菌感染時的細(xì)胞存活率的影響以及細(xì)胞培養(yǎng)液中NO濃度、IL-8、TNF-a、COX2、TLR2和TLR4表達(dá)的變化,Galectin-3與白色念珠菌的結(jié)合測定,激光共聚焦顯微鏡觀察Galectin-3與TLR2、TLR4的表達(dá)分布。 結(jié)果：1、利用通用引物對菌落進(jìn)行PCR檢測。獲得陽性克隆4個,送3號樣品進(jìn)行測序驗證。測序結(jié)果表明,針對galectin-3的shRNA序列已經(jīng)成功連入慢病毒載體。 2、定量PCR和Westernblot檢測表明細(xì)胞內(nèi)的Galectin-3表達(dá)受到顯著的敲減。 3、白色念珠菌刺激U937后,可促進(jìn)細(xì)胞生長,細(xì)胞中IL-8、TNF-a、COX2、TLR2和TLR4表達(dá)增強(qiáng),NO水平呈上升,組別之間有統(tǒng)計學(xué)意義。沉默Galectin-3后細(xì)胞生長受到抑制,細(xì)胞相對存活率下降,細(xì)胞中IL-8、TNF-a、COX2、TLR2和TLR4表達(dá)增強(qiáng),NO水平呈上升,組別之間有統(tǒng)計學(xué)意義。 4、結(jié)合測定結(jié)果隨著白色念珠菌濃度的升高,Galectin-3與白色念珠菌的結(jié)合程度相應(yīng)加深,當(dāng)濃度在107PFU/mL及以上時有明顯上調(diào),組別之間有統(tǒng)計學(xué)意義,當(dāng)濃度在109PFU/mL時,與108PFU/mL組相比,無統(tǒng)計學(xué)意義。沉默Galectin-3后,得到相似結(jié)果。但是結(jié)合程度較對照組明顯下降。 結(jié)論： 1、本實驗成功構(gòu)建了慢病毒載體介導(dǎo)的Galectin-3-shRNA沉默基因人U937巨噬細(xì)胞株模型。 2、Galectin-3對白色念珠菌刺激人巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞后細(xì)胞培養(yǎng)液中NO濃度、IL-8、TNF-α、COX2、TLR2和TLR4表達(dá)的調(diào)節(jié)呈負(fù)相關(guān),對細(xì)胞存活率的影響呈正相關(guān)。 3、Galectin-3能與白色念珠菌直接結(jié)合。 第三部分半乳糖凝集素-3在白色念珠菌誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞中的作用機(jī)制分析 目的：探討半乳糖凝集素-3在白色念珠菌誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞中的作用機(jī)制。 研究方法：蛋白免疫印跡(Western blot)檢測細(xì)胞中FAS、NF-κB、JNK和ERK1/2蛋白含量。 結(jié)果：1、在Galectin-3被抑制的情況下,白念珠菌感染會造成細(xì)胞中FAS和NF-κB蛋白的表達(dá)上調(diào)。 2、在Galectin-3被抑制的情況下,白念珠菌感染會造成細(xì)胞中磷酸化JNK表達(dá)上調(diào)和磷酸化ERK1/2蛋白表達(dá)下調(diào)。 結(jié)論：1、在白色念珠菌誘導(dǎo)的人巨噬細(xì)胞系U937細(xì)胞中Galectin-3參與了MAPK通路的應(yīng)答激活。 Galectin-3通過調(diào)節(jié)Fas和NF-κB的表達(dá)參與抗細(xì)胞凋亡作用。 3、Galectin-3是抑制白念珠菌感染的關(guān)鍵分子和潛在的治療靶標(biāo)。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R379

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2557306