【摘要】：第一部分白色念珠菌對巨噬細胞U937的活化作用 實驗?zāi)康模河^察白色念珠菌對人巨噬細胞系U937細胞的活化作用。 方法：觀察不同濃度不同作用時間點的白色念珠菌刺激人巨噬細胞系U937細胞后細胞培養(yǎng)液中NO濃度和Galectin-3的表達以及對細胞存活率的影響。 結(jié)果：1、白色念珠菌終濃度與巨噬細胞系U937細胞存活率與因子表達：在107PFU/mL及以下時,,促進細胞生長,相對存活率升高,細胞中NO及Galectin-3的表達增強,各組間比較有統(tǒng)計學意義(P0.05)；在108PFU/mL及以上時,可抑制細胞生長,相對存活率降低,細胞中NO及Galectin-3的表達降低,各組間比較有統(tǒng)計學意義(P0.05) 2、白色念珠菌作用時間與巨噬細胞系U937細胞存活率與因子表達：白色念珠菌處理3h及以上時,可促進細胞生長,細胞中NO及Galectin-3的表達增強,各組間比較有統(tǒng)計學意義(P0.05)；白色念珠菌處理3h及以下時,對細胞生長影響不大,細胞中NO及Galectin-3的表達變化不明顯,組別之間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結(jié)論：1、白色念珠菌濃度在107PFU/mL及以下時,刺激人巨噬細胞系U937細胞活化。對NO濃度和Galectin-3的表達以及對細胞存活率的影響呈正相關(guān)。 2、白色念珠菌作用時間3h及以上時人巨噬細胞系U937細胞活化。 第二部分半乳糖凝集素-3在白色念珠菌誘導(dǎo)的人巨噬細胞系U937細胞中的表達及其功能 目的：觀察Galectin-3在白色念珠菌誘導(dǎo)的人巨噬細胞系U937細胞中的表達并探討其功能。 研究方法：通過慢病毒載體介導(dǎo)的Galectin-3-shRNA沉默基因,建立半乳糖凝集素-3基因阻斷的人U937巨噬細胞株模型,體外評價和觀察galectin-3在人巨噬細胞系U937細胞受白色念珠菌感染時的細胞存活率的影響以及細胞培養(yǎng)液中NO濃度、IL-8、TNF-a、COX2、TLR2和TLR4表達的變化,Galectin-3與白色念珠菌的結(jié)合測定,激光共聚焦顯微鏡觀察Galectin-3與TLR2、TLR4的表達分布。 結(jié)果：1、利用通用引物對菌落進行PCR檢測。獲得陽性克隆4個,送3號樣品進行測序驗證。測序結(jié)果表明,針對galectin-3的shRNA序列已經(jīng)成功連入慢病毒載體。 2、定量PCR和Westernblot檢測表明細胞內(nèi)的Galectin-3表達受到顯著的敲減。 3、白色念珠菌刺激U937后,可促進細胞生長,細胞中IL-8、TNF-a、COX2、TLR2和TLR4表達增強,NO水平呈上升,組別之間有統(tǒng)計學意義。沉默Galectin-3后細胞生長受到抑制,細胞相對存活率下降,細胞中IL-8、TNF-a、COX2、TLR2和TLR4表達增強,NO水平呈上升,組別之間有統(tǒng)計學意義。 4、結(jié)合測定結(jié)果隨著白色念珠菌濃度的升高,Galectin-3與白色念珠菌的結(jié)合程度相應(yīng)加深,當濃度在107PFU/mL及以上時有明顯上調(diào),組別之間有統(tǒng)計學意義,當濃度在109PFU/mL時,與108PFU/mL組相比,無統(tǒng)計學意義。沉默Galectin-3后,得到相似結(jié)果。但是結(jié)合程度較對照組明顯下降。 結(jié)論： 1、本實驗成功構(gòu)建了慢病毒載體介導(dǎo)的Galectin-3-shRNA沉默基因人U937巨噬細胞株模型。 2、Galectin-3對白色念珠菌刺激人巨噬細胞系U937細胞后細胞培養(yǎng)液中NO濃度、IL-8、TNF-α、COX2、TLR2和TLR4表達的調(diào)節(jié)呈負相關(guān),對細胞存活率的影響呈正相關(guān)。 3、Galectin-3能與白色念珠菌直接結(jié)合。 第三部分半乳糖凝集素-3在白色念珠菌誘導(dǎo)的人巨噬細胞系U937細胞中的作用機制分析 目的：探討半乳糖凝集素-3在白色念珠菌誘導(dǎo)的人巨噬細胞系U937細胞中的作用機制。 研究方法：蛋白免疫印跡(Western blot)檢測細胞中FAS、NF-κB、JNK和ERK1/2蛋白含量。 結(jié)果：1、在Galectin-3被抑制的情況下,白念珠菌感染會造成細胞中FAS和NF-κB蛋白的表達上調(diào)。 2、在Galectin-3被抑制的情況下,白念珠菌感染會造成細胞中磷酸化JNK表達上調(diào)和磷酸化ERK1/2蛋白表達下調(diào)。 結(jié)論：1、在白色念珠菌誘導(dǎo)的人巨噬細胞系U937細胞中Galectin-3參與了MAPK通路的應(yīng)答激活。 Galectin-3通過調(diào)節(jié)Fas和NF-κB的表達參與抗細胞凋亡作用。 3、Galectin-3是抑制白念珠菌感染的關(guān)鍵分子和潛在的治療靶標。
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R379

【參考文獻】

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本文編號：2557306