【摘要】：血吸蟲病是一種嚴(yán)重危害社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民身體健康的人畜共患寄生蟲病，該疾病流行于76個國家和地區(qū)，目前全球約有血吸蟲病病人2億。我國主要流行日本血吸蟲病，全國現(xiàn)有病人約32.58萬，有螺面積37.4億m2，現(xiàn)階段該疾病仍是我國重要的公共衛(wèi)生問題。從血吸蟲病防治初期開始至今，查滅螺一直是我國血防工作的重點(diǎn)，80年代前，我國主要采取滅螺為主的綜合防治策略，至1992年世界銀行貸款中國血吸蟲病控制項目，氯硝柳胺作為WHO唯一推薦使用的殺螺藥在我國血吸蟲病流行疫區(qū)得到了大面積的推廣應(yīng)用，也正是氯硝柳胺的使用大大推動了我國血吸蟲病防治工作的進(jìn)程。但是文獻(xiàn)報道，不同現(xiàn)場環(huán)境、氣候條件會影響氯硝柳胺的殺螺效果，由此可見，在全國范圍疫區(qū)內(nèi)及各種不同環(huán)境條件采用統(tǒng)一的殺螺劑量會出現(xiàn)殺螺效果不一致的現(xiàn)象，一方面有些疫區(qū)無法達(dá)到預(yù)期的殺螺效果，導(dǎo)致釘螺孳生或擴(kuò)散，不利于疫情的預(yù)防與控制；反之，則有些疫區(qū)施用過量藥物，造成資源浪費(fèi)以及加重環(huán)境負(fù)荷。那么導(dǎo)致上述殺螺效果不一致的原因是不同地區(qū)釘螺本身對氯硝柳胺的敏感性不一致，亦或是釘螺對氯硝柳胺的敏感性受到現(xiàn)場環(huán)境或氣候因素的影響所致，國內(nèi)外均未見相關(guān)報道。本研究通過定量評價釘螺對氯硝柳胺的敏感性受環(huán)境溫度以及釘螺與藥物可接觸時間的影響，并以此為前提，在實(shí)驗室測定不同季節(jié)與不同地區(qū)釘螺對氯硝柳胺的敏感性，從而建立中國大陸釘螺對氯硝柳胺敏感性的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫，旨在為不同現(xiàn)場的殺螺工作選擇正確合理的藥物劑量提供理論支持，并可以在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步制定符合現(xiàn)場實(shí)際的標(biāo)準(zhǔn)化殺螺規(guī)范技術(shù)，在發(fā)揮殺螺藥最佳殺螺效果的同時減少殺螺藥的浪費(fèi)，大量節(jié)約血吸蟲病控制成本的同時進(jìn)一步優(yōu)化資源的配置，大力推進(jìn)血吸蟲病防治工作的進(jìn)程與發(fā)展；另一方面可以最大限度地減少環(huán)境污染，降低環(huán)境負(fù)荷，以保證殺螺舉措的長效、可持續(xù)發(fā)展。 眾所周知，殺螺效果是殺螺藥物篩選與考核的關(guān)鍵要素，然而無論是現(xiàn)場殺螺效果還是實(shí)驗室藥效評價均離不開標(biāo)準(zhǔn)化的藥效評價實(shí)驗方法，需要遵照國際公認(rèn)的實(shí)驗操作規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)操作程序，無論是藥物的來源、實(shí)驗釘螺還是實(shí)驗條件的控制均需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化與規(guī)范化，這樣才能保證實(shí)驗結(jié)果的可靠性、準(zhǔn)確性以及實(shí)驗結(jié)果間的可比性。近年來本實(shí)驗室對氯硝柳胺等相關(guān)殺螺藥的室內(nèi)篩選以及藥效評價方法進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化研究，發(fā)現(xiàn)室內(nèi)浸殺法實(shí)驗所用釘螺數(shù)以10只/組為佳，省工省時，差錯率低，殺螺效果可靠，而且重復(fù)性好；并且每只釘螺的殺螺藥液體積宜大于3.3ml；此外，從野外帶回實(shí)驗室的釘螺在室內(nèi)飼養(yǎng)時間不能超過11d，否則釘螺對殺螺藥的敏感性顯著降低，可影響殺螺效果的評價。上述研究結(jié)果為國內(nèi)殺螺藥藥效評價以及新藥篩選實(shí)驗方法標(biāo)準(zhǔn)化的建立提供了可行性的標(biāo)準(zhǔn)，但是，釘螺每年僅繁殖一代，生命周期相對較長，區(qū)別于光滑雙臍螺和蚊子等媒介可以連續(xù)繁殖傳代，實(shí)驗室內(nèi)多能提供標(biāo)準(zhǔn)的傳代株供生物測定研究，目前實(shí)驗室尚無室內(nèi)傳代的標(biāo)準(zhǔn)株釘螺供相關(guān)實(shí)驗所用，而是從現(xiàn)場采集，每年不同時間進(jìn)行實(shí)驗的釘螺均是從現(xiàn)場即采即用，不同實(shí)驗室所用釘螺來源于不同地區(qū)或不同季節(jié)，那么不同地區(qū)或不同季節(jié)的釘螺對氯硝柳胺的敏感性是否存在差異，這種差異是否對殺螺藥篩選以及藥效評價結(jié)果產(chǎn)生影響？不得而知。本研究通過定量評價釘螺對氯硝柳胺的敏感性受溫度以及釘螺與藥物可接觸時間兩因素的影響，并在此基礎(chǔ)上測定不同地區(qū)與季節(jié)釘螺對氯硝柳胺的敏感性是否存在差異，探討采集于不同地區(qū)與不同季節(jié)的釘螺用于藥效評價與新藥篩選是否會對實(shí)驗結(jié)果產(chǎn)生影響，從而進(jìn)一步完善上述藥效評價與新藥篩選實(shí)驗方法的標(biāo)準(zhǔn)化。 一釘螺對氯硝柳胺敏感性受溫度與時間的影響 本研究從江蘇省鎮(zhèn)江市江灘采集釘螺，帶回實(shí)驗室用草紙盤飼養(yǎng)1-2d后，采用藥物濃度分別為1g/L、0.1g/L、0.01g/L與1mg/L的50%氯硝柳胺乙醇胺鹽可濕性粉劑（WPN）在不同溫度下對其進(jìn)行浸殺實(shí)驗，并通過CLL模型分析WPN在不同溫度浸殺釘螺不同時間的生物測定數(shù)據(jù)，以評價不同溫度以及釘螺與藥物接觸不同時間下WPN的殺螺效果，從而定量分析釘螺對氯硝柳胺的敏感性受溫度以及釘螺與藥物可接觸時間影響的水平和程度。 結(jié)果顯示，溫度與時間效應(yīng)參數(shù)均達(dá)到顯著水平，說明溫度效應(yīng)與時間效應(yīng)均顯著；所建模型通過Hosme-Lemeshow擬合異質(zhì)性檢驗，對各處理所建模型均不存在異質(zhì)性，即該模型能夠較好地擬合WPN浸殺釘螺效果的生物測定數(shù)據(jù)，從而反映釘螺對藥物的敏感性隨溫度以及釘螺與藥物可接觸時間的變化趨勢。不同濃度WPN浸殺釘螺效果經(jīng)CLL模型擬合，溫度效應(yīng)β值分別為2.5264、2.3609、1.6953和4.5557，該值反映了釘螺對各濃度WPN敏感性隨溫度變化的敏感程度。釘螺對各濃度WPN敏感性的時間效應(yīng)參數(shù)最大值分別為：WPN1g/L浸殺20min、WPN0.1g/L浸殺2h、WPN0.01g/L浸殺20h與WPN1mg/L浸殺48h，分別反映了各濃度WPN浸殺釘螺的理論快速死亡期。 根據(jù)CLL模型估計WPN浸殺釘螺不同時間的致死溫度，1g/L的WPN浸殺釘螺1、3、5、10與20min致使釘螺99%死亡所需溫度分別48.42、26.80、19.09、9.50與3.55℃；0.1g/L的WPN浸殺釘螺1、3、5、10、20、60與120min致使釘螺99%死亡所需溫度分別142.99、68.33、45.77、40.43、35.36與1.81℃；0.01g/L的WPN浸殺釘螺低于4h時，致使99%釘螺死亡所需溫度高于100℃，而浸殺8、12、16與20h時所需溫度分別為81.96、58.76、27.61與1.20℃；1mg/L的WPN浸殺釘螺低于8h時，致使99%釘螺死亡所需溫度高于100℃，而延長浸殺時間至72h時，僅需19.44℃�？梢�，時間因素對致死溫度具有一定影響。一般，隨時間的增加，一定濃度的WPN浸殺釘螺所需的溫度逐漸降低，相應(yīng)的致死溫度也隨之降低。同時，由CLL模型還估計出不同溫度下WPN浸殺釘螺的致死時間，0℃時1g/L的WPN浸殺1h能使釘螺99%死亡，溫度升至5℃時，釘螺99%死亡僅需20min，20℃時僅需5min，30℃時不到2min釘螺即可全部死亡；0.1g/L的WPN浸殺時，0℃時99%釘螺死亡需要3h，10℃時不到1h，釘螺即可全部死亡，溫度升高至20℃以上時，僅需30min釘螺即可全部死亡；0.01g/L的WPN浸殺釘螺時，0℃下需要26h釘螺可達(dá)到99%死亡，升高至5℃時則需24h，30℃時則僅需14h釘螺即可99%死亡；而1mg/L的WPN浸殺時，低溫情況下該濃度WPN殺螺效果較差，15℃時仍需6d才能致使99%的釘螺死亡，20、25與30℃時分別需要56、35與22h釘螺才能全部死亡。 結(jié)果表明CLL模型適用于分析殺螺藥殺螺效果的生物測定數(shù)據(jù)，同時也說明了溫度與時間存在相互作用，釘螺對藥物的敏感性同時受溫度以及釘螺與藥物可接觸時間的影響，因此，無論是從有效殺滅釘螺，預(yù)防與控制血吸蟲病的傳播，減少資源浪費(fèi)與環(huán)境污染，或延緩釘螺對其抗藥性的產(chǎn)生出發(fā)，都非常有必要提倡合理使用氯硝柳胺，根據(jù)本研究中CLL模型擬合的不同溫度與釘螺與藥物接觸不同時間下釘螺死亡概率，以及致死溫度與致死時間互為函數(shù)的關(guān)系，氯硝柳胺合理化使用的可操作空間很大�，F(xiàn)場滅螺在考慮當(dāng)?shù)芈萸橐约胺乐文繕?biāo)的實(shí)際需要基礎(chǔ)上，還需根據(jù)現(xiàn)場環(huán)境、氣溫以及天氣因素所控制的釘螺與藥物可接觸時間采用合理的施藥劑量，達(dá)到最佳殺螺效果的同時，減少殺螺藥的濫用及浪費(fèi)，降低環(huán)境污染及減緩釘螺抗藥性的產(chǎn)生；同時在現(xiàn)場滅螺工作中，可以參考滅螺現(xiàn)場當(dāng)時的施藥劑量、溫度以及釘螺與藥物實(shí)際接觸時間，利用CLL模型擬合釘螺死亡概率，對現(xiàn)場滅螺效果進(jìn)行預(yù)測和評價，以及時了解和掌握釘螺控制的進(jìn)程。 二不同季節(jié)釘螺對氯硝柳胺敏感性的測定 本研究自2010年6月至2011年5月止，每月在江蘇鎮(zhèn)江江心洲江灘采集釘螺帶回實(shí)驗室，室內(nèi)用草紙盤飼養(yǎng)1-2d后，選取活力較好的7-8旋成螺作為實(shí)驗用釘螺待用，用脫氯自來水將WPN配制成藥物濃度分別為1.000、0.500、0.25、0.125、0.063、0.032、0.016與0.008mg/L的藥液，在溫度(25±1)℃、濕度60%、光照充足的生物培養(yǎng)箱內(nèi)對上述釘螺進(jìn)行室內(nèi)浸殺實(shí)驗。 浸殺每月釘螺24h的LC50波動范圍為0.143~0.209mg/L，服從正態(tài)分布，均值為0.166mg/L，95%可信區(qū)間為0.152~0.180mg/L。浸殺釘螺48h的LC50波動范圍為0.108~0.170mg/L，服從正態(tài)分布，均值為0.140mg/L，95%可信區(qū)間為0.126~0.153mg/L。對不同濃度WPN浸殺不同月份釘螺死亡率進(jìn)行Logistic多因素回歸分析，浸殺24h與48h組不同月份釘螺死亡率均未見差異；將不同月份按照季節(jié)劃分，不同季節(jié)間釘螺對WPN的敏感性也未見差異。 結(jié)果說明控制溫度、光照等因素，實(shí)驗室條件下WPN對不同月份采集釘螺的殺滅效果較穩(wěn)定，即不同季節(jié)釘螺對WPN的敏感性一致是其生物學(xué)特性，，提示理論上不同季節(jié)滅螺采取統(tǒng)一的推薦劑量是可行的，但是實(shí)際滅螺工作中不同季節(jié)的現(xiàn)場環(huán)境、氣候等因素并不一致，所以在實(shí)際的現(xiàn)場滅螺工作中還是應(yīng)充分考慮現(xiàn)場溫度以及釘螺與藥物可接觸時間，以此為基礎(chǔ)對施藥劑量進(jìn)行適量調(diào)整，以達(dá)到最優(yōu)殺螺效果。同時說明控制溫度、濕度和光照一致的標(biāo)準(zhǔn)化浸殺條件下，全年采集各月當(dāng)時釘螺進(jìn)行浸殺實(shí)驗，不會對實(shí)驗室藥效評價以及殺螺藥篩選結(jié)果產(chǎn)生影響；采集于不同季節(jié)的釘螺用于實(shí)驗也不會影響釘螺對殺螺藥抗藥性縱向監(jiān)測的準(zhǔn)確性。 三不同地區(qū)釘螺對氯硝柳胺敏感性的測定 本研究共抽取了我國10個血吸蟲病流行省份，37個采樣點(diǎn)采集釘螺，所采集釘螺帶回實(shí)驗室用草紙盤飼養(yǎng)1-2d后，選取活力較好的7-8旋成螺作為實(shí)驗用釘螺待用，WPN用脫氯自來水分別配制成藥物濃度為1.000、0.500、0.25、0.125、0.063、0.032、0.016與0.008mg/L的藥液，在溫度(25±1)℃、濕度60%、光照充足的生物培養(yǎng)箱內(nèi)對上述不同地區(qū)所采集釘螺進(jìn)行室內(nèi)浸殺實(shí)驗。 WPN浸殺37個采樣點(diǎn)所采集釘螺24h的LC50均數(shù)為0.157mg/L，其95%可信區(qū)間為0.142-0.174mg/L；而WPN浸殺36個（除湖南石門）采樣點(diǎn)所采集釘螺48h的LC50均數(shù)為0.114mg/L，其95%可信區(qū)間為0.102-0.126mg/L；各采樣點(diǎn)釘螺對WPN的敏感性并未顯示出地域性或地理性聚類現(xiàn)象；不同省份、不同類型流行區(qū)釘螺對WPN的敏感性差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而將本次不同地區(qū)釘螺對WPN的敏感性測定結(jié)果與戴建榮等（2002年）敏感性測定結(jié)果進(jìn)行比較，所有采樣點(diǎn)釘螺之間以及重合采樣點(diǎn)間釘螺對WPN的敏感性也均無統(tǒng)計學(xué)差異。 研究結(jié)果表明，不同地區(qū)或不同類型流行區(qū)釘螺對氯硝柳胺的敏感性未見差異，與2002年調(diào)查結(jié)果比較，大陸釘螺對氯硝柳胺的敏感性也未發(fā)現(xiàn)降低趨勢。提示我們氯硝柳胺在不同現(xiàn)場殺螺效果不一致，并不是因為不同地區(qū)釘螺對氯硝柳胺的敏感性存在差異，或釘螺對氯硝柳胺產(chǎn)生了抗藥性，而可能是不同現(xiàn)場的環(huán)境、氣候等因素的差異所致，所以今后的滅螺工作中需因地制宜，考慮滅螺現(xiàn)場的環(huán)境、氣候因素，從而對施藥量進(jìn)行適量校正，以達(dá)到最優(yōu)的殺螺效果；其次，不同實(shí)驗室進(jìn)行殺螺藥藥效評價以及新藥篩選時，采集于不同現(xiàn)場的釘螺本身對殺螺藥的敏感性差異不會對實(shí)驗結(jié)果產(chǎn)生影響，不同實(shí)驗室間殺螺藥藥效評價以及新藥篩選結(jié)果具有可比性；雖然未發(fā)現(xiàn)中國大陸釘螺對氯硝柳胺的敏感性發(fā)生實(shí)質(zhì)性變化，但繼續(xù)建立和完善中國大陸釘螺對氯硝柳胺敏感性數(shù)據(jù)庫仍十分必要。 綜上所述，釘螺對氯硝柳胺的敏感性受溫度以及釘螺與藥物可接觸時間的影響；但研究未發(fā)現(xiàn)不同季節(jié)或不同地區(qū)的釘螺對氯硝柳胺的敏感性存在差異；通過與2002年測定結(jié)果比較，自2002年至今，大陸釘螺對氯硝柳胺的敏感性未發(fā)現(xiàn)明顯的上升或下降趨勢，即未發(fā)現(xiàn)大陸釘螺對氯硝柳胺表現(xiàn)出抗藥性。所以在今后的現(xiàn)場滅螺工作、實(shí)驗室殺螺藥篩選與藥效評價，以及釘螺對殺螺藥的抗藥性監(jiān)測工作中，除考慮藥物濃度因素外，還有必要考慮環(huán)境溫度、釘螺與藥物可接觸時間等因素的影響。而在溫度、濕度和光照等條件一致的標(biāo)準(zhǔn)化浸殺條件下，全年采集于不同季節(jié)或不同地區(qū)的釘螺用于藥效評價與新藥篩選是可行的，結(jié)果不會受到釘螺自身敏感性的影響，不同實(shí)驗室間相關(guān)的實(shí)驗結(jié)果具有一定的可比性；采集于不同季節(jié)或不同地區(qū)的釘螺也不會影響釘螺對殺螺藥抗藥性監(jiān)測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
【圖文】：

圖 1-2 WPN 1 g/L 浸殺釘螺死亡率隨溫度、浸殺時間變化三維圖Fig.1-2 Mortalities of snails immersed in 1 g/L concentration of WPN over temperaturand immersion time圖 1-3 為 1 g/L 的 WPN 浸殺釘螺死亡率等高線圖，X 軸表示浸殺時間，Y 示溫度，不同顏色條紋表示釘螺死亡率情況。如圖所示，低溫下釘螺死亡率殺時間的變化較明顯， 0 ℃時浸殺 1 min 時釘螺死亡率僅 30 %，而延長浸殺至 20 min 時，釘螺死亡率可以達(dá)到 70%左右；而溫度達(dá)到 15 ℃時，浸殺不 min 釘螺死亡率即可達(dá)到 100%，即達(dá)到一定溫度時，該濃度的 WPN 短時間即到高效且穩(wěn)定的殺螺效果。

圖 1-3 WPN 1 g/L 浸殺釘螺死亡率隨溫度、浸殺時間變化等高線圖Fig.1-3 Mortalities contour line of snails immersed in 1 g/L concentration of WPN ovtemperature and immersion time1.2 CLL 模型1.2.1 CLL 模型擬合對 1 g/L 的 WPN 在不同溫度、浸殺時間下的殺螺效果進(jìn)行 CLL 模型模擬分和參數(shù)估計。為獲得式（1）中的 τj，須先求出式(2) 中的參數(shù) γj，并通過下面(3) 根據(jù) γj計算出參數(shù) τj。參數(shù) γj和 β 則可根據(jù)實(shí)驗數(shù)據(jù), 對式 (2) 應(yīng)用非線性小二乘法，使條件增長概率的觀察值和擬合值達(dá)到最小來獲得。
【學(xué)位授予單位】：江蘇省血吸蟲病防治研究所
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R383.24

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2556676