【摘要】：目的觀察巖藻糖基化轉(zhuǎn)移酶VI（FTVI）體外巖藻糖基化修復(fù)技術(shù)聯(lián)合DiprotinA體外阻斷CD26水解酶活性技術(shù)對臍血HSC歸巢缺陷的作用，探討經(jīng)兩種技術(shù)聯(lián)合處理后的臍血HSC的植入能力，研究兩種技術(shù)的修復(fù)效果及相互作用。 方法免疫磁珠分選純化出新鮮臍血的CD34+細胞。使用FTVI體外對臍血CD34+造血干細胞（HSC)進行巖藻糖基化處理，采用流式細胞儀檢測處理后的CD34+HSC表面P/E選組素配體功能基團sLex（CD162和CLA)的表達水平。使用Diprotin A體外阻斷CD26水解酶活性，采用流式細胞儀檢測處理后的CD34+HSC表面CD26表達水平,使用微板熒光分光光度計檢測阻斷后CD26酶活性。設(shè)立實驗分組（空白對照組、CD34+細胞對照組、巖藻糖基化處理組、CD26酶活性阻斷組、巖藻糖基化處理/CD26酶活性阻斷聯(lián)合處理組），建立NOD/SCID鼠造血干細胞移植模型，將新鮮分離純化的臍血CD34+HSC經(jīng)體外處理后按分組進行移植動物實驗，觀察移植后小鼠生存情況，使用流式細胞術(shù)檢測移植后小鼠外周血中人CD45+細胞表達水平的變化至移植后6周。采用流式細胞術(shù)和微板熒光分光光度計檢測兩種技術(shù)之間是否存在相互作用。 結(jié)果1.體外巖藻糖基化修復(fù)技術(shù)和CD26水解酶活性阻斷技術(shù)修復(fù)效果檢測：臍血CD34+HSC體外行巖藻糖基化工程后，P選擇素配體活性基團（處理前后分別為（75.19±1.15）%和（94.11±1.21）%，P0.05）和E選擇素配體活性基團（處理前后分別為（25.01±1.00）%和（53.52±1.17）%，P0.05）表達比例均明顯升高。臍血CD34+HSC體外行CD26活性阻斷處理后，CD26表達無明顯變化（處理前后分別為（10.92±1.52）%和（9.88±0.95）%，P0.05）但是活性基本喪失(P0.05)。 2.NOD/SCID小鼠異基因臍血移植模型建立后的植入情況和生存情況：1）植入情況從第2周開始可以檢測到人CD45+細胞的表達，第2周僅聯(lián)合處理組外周血中有人CD45+的細胞，為（0.45±0.78）%。第4周各組外周血均可檢測出人CD45+細胞，其CD34+細胞對照組、糖基化組、CD26活性阻斷組和聯(lián)合處理組CD45+細胞所占比例分別為（0.73±0.22）%、（2.95±0.12）%、（3.21±0.43）%、（8.87±0.83）%。第6周各組外周血均亦可檢測出人CD45+細胞，其CD34+細胞對照組、糖基化組、CD26活性阻斷組和聯(lián)合處理組CD45+細胞所占比例分別為（12.87±0.62）%、（29.41±0.21）%、（32.76±0.42）%、（41.07±0.32）%。2）生存情況照光后注射等體積生理鹽水未行HSC移植的小鼠均在1周內(nèi)全部死亡，實驗組小鼠的中位生存期均超過6周。死亡高峰時間為照射后1周，移植后6周CD26活性阻斷組和聯(lián)合處理組生存率明顯高于其他各組（生存率：CD34+細胞對照組為40%，糖基化組為40%，CD26活性阻斷組為80%，聯(lián)合處理組為80%，P0.05） 3.體外巖藻糖基化修復(fù)技術(shù)和CD26水解酶活性阻斷技術(shù)的相互作用檢測：CD26活性阻斷前后臍血HSC表面P選擇素配體功能基團的表達無明顯變化（處理前后分別為（75.19±1.15）%和（74.01±1.27）%，P0.05）。E選擇素配體功能基團的表達無明顯變化（處理前后分別為（25.01±1.00）%和（25.50±1.41）%，P0.05）。巖藻糖基化工程處理前后臍血HSC表面CD26的表達（處理前后分別為（10.92±1.52）%和（10.44±1.16）%，P0.05）和活性（處理前后分別為65.34U和65.68U，P0.05）亦無明顯變化。 結(jié)論1.研究發(fā)現(xiàn)巖藻糖基化處理和CD26活性阻斷技術(shù)可以在體外成功修復(fù)和干預(yù)臍血HSC的歸巢缺陷。2.體內(nèi)動物實驗發(fā)現(xiàn)兩種修復(fù)技術(shù)均可提高臍血造血干細胞的植入速率和移植小鼠生存率，聯(lián)合使用優(yōu)于單獨使用其中一種技術(shù)。3.巖藻糖基化工程技術(shù)對臍血HSC表面CD26表達和活性均無明顯影響，CD26活性阻斷技術(shù)對臍血HSC表面P/E選擇素配體活性基團的表達亦無明顯影響。兩種技術(shù)分別作用于歸巢的不同靶點，兩者聯(lián)合有疊加作用，且無相互抑制作用，但暫未發(fā)現(xiàn)兩種技術(shù)有相互促進作用。
【圖文】：

圖 1.分選出 CD34+細胞純度Fig1. The purity of the isolated cord blood CD34+ce：修復(fù)和干預(yù)后臍血 HSC 動物體內(nèi)移植效果各組植入情況比較 2 周各組小鼠的外周血中人 CD45 的表達：僅聯(lián)D45 的表達，比例為：（0.45±0.78）%，其余各組

圖 2. 移植后 2 周小鼠的外周血中人 CD45 的表xpression of CD45 in peripheral blood of mice 2 weeks p第 4 周各組小鼠的外周血中人 CD45 的表達：所有45 的表達，，其中對照組比例為：（0.73±0.22）%，CD26 活性阻斷組比例為（3.21±0.43）%，糖（8.87±0.83）%。糖基化組比例略高于其余各組
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329

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本文編號：2556483