【摘要】：銅綠假單胞菌(Dseudomonas aeruginosa)是臨床上重要的革蘭氏陰性條件致病菌。該菌分布廣泛,可導(dǎo)致人體不同組織的感染。銅綠假單胞菌是導(dǎo)致醫(yī)院內(nèi)感染的主要病原菌之一,并且對多種抗生素具有很高的抗性,難以治療[Pier.2002]。 RsmA是銅綠假單胞菌的一種RNA結(jié)合蛋白,可以結(jié)合rnRNA前導(dǎo)序列,從而阻礙轉(zhuǎn)錄起始位點與核糖體的結(jié)合,實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)。RsmA、RsmY和RsmZ組成Rsm調(diào)節(jié)系統(tǒng),該系統(tǒng)又與銅綠假單胞菌的雙組分系統(tǒng)相互作用,依賴于GacS/GacA系統(tǒng)并受RetS和LadS的調(diào)節(jié)。RsmA作為N-乙酰高絲氨酸內(nèi)酯的負(fù)調(diào)節(jié)因子,可對群體感應(yīng)(Quorum sensing)系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié),還負(fù)調(diào)節(jié)抗生素抗性、N-乙酰高絲氨酸及胞外酶的合成；正調(diào)節(jié)細(xì)菌叢動、菌喹諾酮信號分子的合成。此外,還影響Ⅲ型分泌系統(tǒng),胞外產(chǎn)物(如綠膿菌素、氰化氫、IL-凝集素)的形成,毒性相關(guān)基因的表達(dá)。臨床研究表明,RsmA缺失的銅綠假單胞菌其致病能力也發(fā)生了明顯的變化。 盡管人們對RsmA在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上的調(diào)節(jié)作用做了大量研究,但其具體調(diào)控機(jī)制并不是很清楚。本研究在全基因組水平上,采用轉(zhuǎn)座突變的方法,篩選了那些對rsmA具有調(diào)節(jié)作用的基因,并對其中一些重要基因進(jìn)行了深入研究。 本研究將目的基因rsmA啟動子經(jīng)PCR擴(kuò)增,克隆到缺失啟動子并含有報道子luxCDABE熒光素酶的pMS402質(zhì)粒載體上,連接到含有整合位點的CTX6.1質(zhì)粒,可利用噬菌體結(jié)合位點進(jìn)行位點專一性重組,將rsmA-LuxCDABE整合到銅綠假單胞菌的基因組上,得到構(gòu)建菌株P(guān)AO1(CTX-rsmA),具有比質(zhì)粒更穩(wěn)定的遺傳復(fù)制,發(fā)光值直接反應(yīng)rsmA基因的表達(dá)情況。實驗利用轉(zhuǎn)座子pBT20隨機(jī)插入受體菌染色體上的原理,對PAO12(CTX-rsmA)進(jìn)行隨機(jī)轉(zhuǎn)座突變,篩選到9株影響,smA表達(dá)的突變體。通過對這9株突變體進(jìn)行隨機(jī)PCR,確定突變體中轉(zhuǎn)座子在染色體上插入的具體位點,從而確定調(diào)節(jié)基因。再根據(jù)生物信息分析和實驗結(jié)果,推測這些調(diào)節(jié)基因的功能。同時對這9株轉(zhuǎn)座突變體進(jìn)行了一系列的表型測定,如生物膜、綠膿菌素、剛果紅試驗、運動性試驗、抗生素敏感性試驗,研究了這些基因的生物學(xué)功能。選取對剛果紅、運動性、抗生素敏感性等都發(fā)生明顯變化的突變菌株A7,對其進(jìn)行了互補試驗。深入研究表明,A7轉(zhuǎn)座突變體中被破壞的基因為pgi(PA4732),它編碼6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶,在銅綠假單胞菌碳源代謝中發(fā)揮作用,將pgi基因敲除,得到了Δpgi。這一敲除突變體與轉(zhuǎn)座突變株A7表型一致,研究結(jié)果將rsmA基因同碳源代謝系統(tǒng)相聯(lián)系。這些結(jié)果為了解銅綠假單胞菌致病因子的調(diào)節(jié)機(jī)理提供了新的數(shù)據(jù)和線索。
【圖文】：

圖2pA中Rets、Lads作用于eaeA一Rsm調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的模式圖[Jameseta一，20感應(yīng)系統(tǒng)的表達(dá)和一系列胞外產(chǎn)物，如彈性蛋白酶、溶葡球菌酶和彈表達(dá)受Gac/Rsm系統(tǒng)的雙重作用。以HCN的合成為例約30%的HC通過增加C4一HSL的編碼基因rkll的表達(dá)，C4一HSL激活刃11R的轉(zhuǎn)錄

頭代表正調(diào)節(jié)。GacA正調(diào)節(jié)群體感應(yīng)系統(tǒng)和毒性因子的表達(dá)。Rsm如次級代謝、毒性因子[Heurlieretal.，2004]。同源調(diào)節(jié)子LasR和燦IR相關(guān)，調(diào)節(jié)堿性蛋白酶、etal.，1993:Reimmannetal.，1997]。鼠李糖脂作為在固體表明擴(kuò)張。RsmA影響泳動可能與鼠李糖ifietal.，1995]。網(wǎng)絡(luò)QS的調(diào)節(jié)子，控制PQS、綠膿菌素、彈性蛋白酶，通過Mv僅間接調(diào)節(jié)PQS產(chǎn)量，Mv僅直接結(jié)錄[Deziel。taz.，2005;Diggleetal.，2003;Gallaghe轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)Mv很IDezieletal.，2005]。rsmA的缺達(dá)升高，而MexEF一oprN泵可將大量抗生素和
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R378

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本文編號：2556305