【摘要】：丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）是引起慢性肝臟疾病的主要原因之一，全世界約有1.7億HCV感染者，丙肝感染已成為全球性的、嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。HCV感染后，約50%～85%發(fā)展為慢性肝病，甚至肝纖維化、肝硬化、肝細(xì)胞癌。目前，聚乙二醇干擾素-α和利巴韋林聯(lián)合應(yīng)用是丙型肝炎治療的標(biāo)準(zhǔn)方案，其持續(xù)應(yīng)答率只有50%，且副作用大，費(fèi)用昂貴，停止治療后仍有很高的復(fù)發(fā)率。目前還沒有有效的抗HCV疫苗，所以研制預(yù)防性和治療性抗HCV疫苗很重要。 以抗原表位預(yù)測(cè)和人工合成抗原表位基因?yàn)榛A(chǔ)的多表位DNA疫苗是新型疫苗研究熱點(diǎn)。表位又稱抗原決定簇，是指免疫細(xì)胞能識(shí)別的抗原分子上的一個(gè)特定部位，可以和病毒的受體結(jié)合。重組多表位疫苗是指同時(shí)攜帶多個(gè)目標(biāo)抗原相關(guān)表位以及輔助性表位的疫苗，它能有效地應(yīng)付病原微生物的變異，克服主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子的遺傳限制，為特異性免疫治療和基因治療奠定了基礎(chǔ)。要獲得具有較強(qiáng)免疫原性的HCV多肽，廣泛地激發(fā)機(jī)體的CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，必須具有HCV不同區(qū)段的多個(gè)表位。我們利用生物信息學(xué)方法，用計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)出12條多肽，分別用每條肽體外刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞，觀察其增殖情況，ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)上清中IFN-γ水平的變化。結(jié)果顯示預(yù)測(cè)的HCV CTL表位NS4B(1793-1801)和P7（774-782）在體外能夠刺激T細(xì)胞反應(yīng)。 樹突狀細(xì)胞是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，是啟動(dòng)、調(diào)控并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)，其最大特點(diǎn)在于能夠激活初始型T細(xì)胞，啟動(dòng)獲得性免疫，故是機(jī)體免疫應(yīng)答的始動(dòng)者，在免疫反應(yīng)中起到舉足輕重的作用。目前，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)DC制成的DC疫苗已成為研究的熱點(diǎn)。利用腺病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移，以其高效和良好的靶向性成為基因治療中常用的方法。 我們?cè)诖搜芯炕A(chǔ)上構(gòu)建含能表達(dá)這兩個(gè)HCV多CTL表位的DC疫苗，體外觀察其促進(jìn)T細(xì)胞的反應(yīng)和細(xì)胞毒殺傷效應(yīng)，為抗HCV的DC疫苗研制打下基礎(chǔ)。 1．DC的體外培養(yǎng)和鑒定 全血來自于健康供者，經(jīng)Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），按CD14MicroBeads humanmonocyte kit(MACS)操作說明，分離收集CD14+單核細(xì)胞。用無血清培養(yǎng)液X-VIVO15調(diào)整CD14~+單核細(xì)胞密度為1×10~6cells/mL接種于24孔板，并加入GM-CSF(1000U/ml)和IL-4(1000U/ml)5%C02，37℃孵育培養(yǎng)5天，隔日半量換液，，第5天起加入成熟誘導(dǎo)因子TNF-α（10ng/mL）、IL-1β（10ng/mL）、IL-6（10ng/mL）、PGE2（1μg/mL）培養(yǎng)2天，即可誘導(dǎo)出成熟的樹突狀細(xì)胞。顯微鏡和流式細(xì)胞儀觀察和鑒定DC成熟狀態(tài)。 2．負(fù)載HCV多表位的腺病毒刺激DC 重組腺病毒表達(dá)質(zhì)粒AD1（多HCV表位）、AD2(陽性對(duì)照)和AD3（陰性對(duì)照）以50至1000感染復(fù)數(shù)（MOI）感染DC，于感染后48h熒光鏡下觀察細(xì)胞GFP的表達(dá)，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）測(cè)定腺病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染DC的效率。PCR和Western blot檢測(cè)DC細(xì)胞內(nèi)重組HCV多表位抗原基因序列的存在和表達(dá)。 3．DC體外刺激T細(xì)胞 收集感染重組腺病毒和未感染重組腺病毒的DC作為刺激細(xì)胞，取CD14-PBMC為效應(yīng)細(xì)胞，進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)。ELISA檢測(cè)DC上清IL-12p70和混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ。用LDH釋放法檢測(cè)CTL活性。 結(jié)果： 1．DC呈半懸浮生長(zhǎng)，胞體不規(guī)則增大，胞膜向外伸出呈樹枝樣突起。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不成熟DC、成熟DC和腺病毒感染DC的表面標(biāo)志CD83、CD86、CD80和HLA-DR，結(jié)果顯示成熟DC和腺病毒感染DC比不成熟DC的表面標(biāo)志表達(dá)明顯升高。 2．重組腺病毒有效感染DC，熒光鏡下細(xì)胞有GFP的表達(dá)。用特異性引物對(duì)重組腺病毒感染24h后DC的總RNA進(jìn)行PCR，，結(jié)果顯示在150bp處有特異性擴(kuò)增條帶，其大小與目的基因大小相符。用鼠抗FLAG抗體為一抗， HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗，對(duì)重組腺病毒感染48h后DC的總蛋白進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果可見大小約為10KD的蛋白，這與預(yù)計(jì)的序列1-FLAG和序列2-FLAG融合蛋白大小一致，表明DC成功表達(dá)出序列1和序列2蛋白。 3．DC能刺激T細(xì)胞增殖，腺病毒感染DC分泌IL-12p70增多，其刺激T細(xì)胞分泌IFN-γ增多。重組多CTL表位腺病毒感染的DC可誘導(dǎo)特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答。 綜上所述，重組多CTL表位腺病毒在體外能有效感染DC，促進(jìn)T細(xì)胞反應(yīng)，為下一步抗HCV的DC疫苗研制打下基礎(chǔ)。
【圖文】：

一、HCV 感染的后免疫應(yīng)答HCV 基因組有 9.6kb，編碼 3010aa 的多肽，由結(jié)構(gòu)蛋白（Core、E1 和E2）和 7 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和 NS5B）組成[1](圖 1)。

在持續(xù) HCV 基因組復(fù)制過程中，盡管有強(qiáng)烈的 CD8+T 細(xì)胞反應(yīng)，許多 T 細(xì)胞表位是完整的且不發(fā)生變異[4]。這些觀察表明，突變逃避不是逃避抗原特異性 T 細(xì)胞的唯一機(jī)制。表明有多個(gè)互補(bǔ)的途徑如功能性無能和調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞群的生成，導(dǎo)致病毒持久維持[5]（圖 2）。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392


本文編號(hào)：2555620