【摘要】：研究背景：軟骨組織損傷后的自我修復能力極低,是臨床難治疾病之一。軟骨組織工程為軟骨組織缺損修復提供了新的途徑。骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)因其取材方便,體外擴增能力強及具有軟骨分化潛能,已逐漸成為軟骨組織工程的重要種子細胞來源之一。但是現(xiàn)有的誘導BMSCs向軟骨分化的方法存在誘導效率低,效果不穩(wěn)定,非生理性誘導等缺點,尋找更加有效的誘導方法勢在必行。 已有研究發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)微環(huán)境能夠促進BMSCs軟骨分化。軟骨細胞是軟骨組織中的唯一細胞類型,是關(guān)節(jié)微環(huán)境內(nèi)最主要成分。課題組在前期研究中通過軟骨細胞與BMSCs混合共培養(yǎng)證實了軟骨細胞能夠部分模擬關(guān)節(jié)內(nèi)的軟骨微環(huán)境誘導BMSCs軟骨分化,并進一步建立了軟骨細胞-材料復合物和BMSCs-材料復合物的隔離共培養(yǎng)體系,證實軟骨細胞-材料復合物分泌的可溶性因子能夠單獨誘導BMSCs向軟骨細胞分化。 本課題中,我們設(shè)想從軟骨細胞分泌的可溶性因子中篩選有誘導作用的關(guān)鍵因子,從而指導我們建立成分明確,效果穩(wěn)定的誘導方法。然而,可溶性因子成分種類繁多,一一進行分析是不現(xiàn)實的,我們需要一種大容量,多因素的分析方法。蛋白質(zhì)組學是對蛋白質(zhì)進行大規(guī)模研究的一門科學,具有大規(guī)模,高通量等優(yōu)點,可用于研究極其復雜的多種細胞因子和蛋白質(zhì)的變化。與之相互補的蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是近年來蛋白質(zhì)組學研究中興起的一種新的方法,是一種高通量,靈敏度更高且具有高度準確性的研究方法,能在一次實驗中提供相當大的信息量,使我們能夠全面、準確的研究蛋白表達譜,這是傳統(tǒng)的蛋白研究方法無法做到的�，F(xiàn)在這兩種技術(shù)已逐漸成為干細胞和組織工程領(lǐng)域的重要研究方法。因此,我們考慮通過差異蛋白質(zhì)組學和蛋白質(zhì)芯片技術(shù)從軟骨細胞分泌的可溶性因子中篩選有主要誘導作用的因子。 通過差異蛋白質(zhì)組或蛋白芯片篩選有誘導作用的因子,我們要解決的第一個關(guān)鍵問題是必須要找到合適的比較對象,兩者差異太大勢必增加分析時的難度和工作量；兩者差異太小,可能會遺漏一些重要因子。我們設(shè)想軟骨細胞-材料復合物在形成組織工程化軟骨和成熟過程類似于體內(nèi)軟骨形成過程,在這一過程中所分泌因子在不同時期的組成成分和含量是不一樣的：軟骨細胞-材料復合物在組織形成過程中分泌的因子是軟骨形成過程中所需的,更能有效誘導BMSCs軟骨分化；而后期的軟骨細胞-材料復合物已基本形成了軟骨組織,分泌的因子種類和劑量可能以維持軟骨形態(tài)為主,而非誘導分化為主的因子。因此,我們設(shè)想首先對不同時期的軟骨細胞-材料復合物的誘導作用進行系統(tǒng)的比較,從而為差異蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)芯片實驗確定合適的比較樣本,為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。 進行差異蛋白質(zhì)組或蛋白芯片實驗的另一個關(guān)鍵問題是無血清培養(yǎng)基的建立。血清中的高豐度蛋白會影響蛋白實驗結(jié)果,但是,直接去除血清會影響軟骨細胞體外培養(yǎng)過程中的存活、增殖、軟骨表型的維持,以及軟骨組織的構(gòu)建。因此,我們實驗中需要建立一種良好的無血清培養(yǎng)基,既能維持軟骨細胞的正常表型和軟骨組織形成,又不會干擾蛋白質(zhì)組和蛋白芯片的實驗結(jié)果。我們根據(jù)文獻報道和初步的實驗篩選,選取了能夠促進軟骨細胞存活和增殖,有利于軟骨細胞表型保持和細胞外基質(zhì)分泌的因子和非蛋白物質(zhì),如胰島素鐵硒傳遞蛋白,地塞米松和維生素C。然后,研究了它們作為無血清培養(yǎng)基主要成分對軟骨細胞表型維持和軟骨組織構(gòu)建的影響,并最終建立了符合實驗需要的無血清培養(yǎng)基。 通過上述兩個關(guān)鍵問題的解決,為我們后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。我們應用高通量的差異蛋白質(zhì)組學技術(shù)和蛋白質(zhì)芯片技術(shù),對具有不同誘導能力的軟骨細胞-材料復合物分泌的可溶性因子作比較,找到差異蛋白,初步篩選了可能具有軟骨誘導作用的關(guān)鍵因子,期望能有利于建立成分明確,效果穩(wěn)定的誘導方法,為軟骨組織工程向臨床應用轉(zhuǎn)化提供理論和技術(shù)支持。研究目的：將組織工程技術(shù)與蛋白質(zhì)芯片和差異蛋白質(zhì)組學相結(jié)合,從軟骨細胞分泌的可溶性因子中篩選關(guān)鍵的軟骨誘導因子,以期幫助建立成分明確,效果穩(wěn)定的誘導方法,為以BMSCs為種子細胞的軟骨組織工程應用于臨床奠定理論基礎(chǔ),提供技術(shù)支持。 方法和結(jié)果： 1不同時期軟骨細胞-材料復合物誘導作用的比較 方法建立隔離共培養(yǎng)體系,通過軟骨細胞-材料復合物與BMSCs-材料復合物的隔離共培養(yǎng),觀察和比較軟骨細胞接種支架材料3天后(3d組),2周后(2w組)和8周后(8w組)開始的隔離共培養(yǎng)中軟骨細胞-材料復合物分泌的可溶性因子對BMSCs成軟骨誘導作用的差異。 結(jié)果3d組BMSCs-材料復合物形成了較均勻的軟骨樣組織,組織學呈現(xiàn)典型的軟骨陷窩結(jié)構(gòu)；2w組僅在周邊部形成了典型的軟骨樣結(jié)構(gòu),內(nèi)部則為纖維狀成分；晚期8周組則收縮變形,僅形成了纖維樣結(jié)構(gòu)。 結(jié)論軟骨細胞分泌的可溶性因子能夠誘導BMSCs成軟骨分化,而且早期軟骨細胞-材料復合物的分泌液對BMSCs的成軟骨誘導作用明顯強于晚期分泌液的誘導作用。 2無血清培養(yǎng)基的建立 方法培養(yǎng)豬耳軟骨細胞,分為無血清組和含血清組,無血清組應用包含胰島素鐵硒傳遞蛋白(ITS)、地塞米松及維生素C為主要成分的無血清培養(yǎng)基,含血清組應用包含10%血清的常規(guī)培養(yǎng)基,觀察了平面和三維培養(yǎng)狀態(tài)下無血清培養(yǎng)基對軟骨細胞增殖,基質(zhì)分泌和軟骨形成的作用。 結(jié)果平面培養(yǎng)條件下,無血清培養(yǎng)組的細胞增殖率出現(xiàn)輕度下調(diào),但在三維培養(yǎng)情況下可以保持軟骨細胞存活和軟骨細胞的表型,在二型膠原和蛋白多糖染色方面與含血清組相當,軟骨特異基因ColⅡ, Aggrecan的表達與含血清組無明顯差異,并能夠形成較好的軟骨樣組織。 結(jié)論以ITS,地塞米松及維生素C為主要成分建立的無血清培養(yǎng)基在三維培養(yǎng)條件下能基本保持軟骨細胞的存活和表型,能用于軟骨細胞的體外三維培養(yǎng)。 3軟骨細胞-材料復合物分泌的可溶性因子中具有軟骨誘導作用因子的初步篩選 方法培養(yǎng)人肋軟骨來源軟骨細胞,藻酸鹽凝膠包埋,接種PGA/PLA材料后,體外培養(yǎng)3天后開始交替無血清和含血清培養(yǎng),交替時間為3天,取無血清培養(yǎng)的上清作樣本,將培養(yǎng)2周內(nèi)的上清樣本作為早期組,將培養(yǎng)8周-10周的上清樣本作為晚期組,兩組樣本經(jīng)過差異蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)芯片初步篩選差異蛋白,并從基因水平和蛋白水平證實其表達差異。初步將所篩選蛋白IGFBP-4,6用于誘導成分,觀察其對BMSCs成軟骨的誘導作用。 結(jié)果：差異蛋白組學發(fā)現(xiàn)早期和晚期有52個差異點(差異大于2倍),選取其中30個點進行質(zhì)譜分析,鑒定出蛋白13個,其中具有軟骨誘導作用的蛋白因子還在進一步篩選證實中。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)軟骨細胞早期分泌較晚期有6個因子高表達(差異大于2倍),包括胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白2,4和6(IGFBP-2,4,6)和成纖維細胞生長因子2,6(FGF-2,6),將IGFBP-4,6作為候選因子,通過ELISA實驗和PCR檢測從蛋白水平和基因水平證實這兩個因子在早期和晚期的軟骨細胞-材料復合物分泌液和組織中的表達差異。 結(jié)論：蛋白質(zhì)芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)IGFBP-4,6等6個生長因子類蛋白在早期高表達,差異蛋白組學發(fā)現(xiàn)52個差異點,具有軟骨誘導作用的蛋白因子需要進一步篩選。 4 IGFBP-4,6誘導BMSCs成軟骨分化的作用研究 方法：將IGFBP-4,6作為誘導成分單獨(IGFBP4,6單獨誘導組)應用或添加于BMSCs常規(guī)成軟骨誘導液中(聯(lián)合誘導組),觀察IGFBP-4,6誘導BMSCs成軟骨情況,對照組1應用含有轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ-1)的常規(guī)成軟骨誘導液,對照組2應用未添加TGFβ-1的基本軟骨誘導液。在20天分別取材行大體觀察,HE,甲苯胺藍染色和二型膠原免疫組化染色,半定量PCR方法檢測成軟骨相關(guān)基因的表達變化。 結(jié)果：誘導第20天可在對照組1和聯(lián)合誘導組的pellets周邊部看到軟骨陷窩的形成,甲苯胺藍染色和二型膠原免疫組化染色更陽性,主要分布在pellets的外周。對照組2和IGFBP4,6單獨誘導組未見軟骨樣組織形成。PCR結(jié)果顯示,軟骨特異基因二型膠原(ColⅡ)和核心蛋白(Aggrecan)在四組均有陽性表達,其中聯(lián)合誘導組和對照組1的表達明顯的強于另外兩組,Aggrecan的表達在聯(lián)合誘導組強于對照組1；Sox9僅在陽性對聯(lián)合誘導組和對照組1表達,聯(lián)合誘導組明顯強于陽性對照組。 結(jié)論：100ng/ml IGFBP-4和100ng/m6尚不能單獨誘導BMSCs成軟骨分化,但是可能與TGFβ-1協(xié)同作用促進TGFβ-1的成軟骨誘導作用。 綜上所述,本研究將組織工程技術(shù)與差異蛋白質(zhì)組學相結(jié)合,從一個全新的,系統(tǒng)的角度來研究軟骨細胞分泌的可溶性因子,篩選其中有主要誘導作用的因子,為建立良好的誘導方法提供了依據(jù),具有重要的科學意義和研究價值。而且篩選出有主要誘導作用的因子,可以指導我們建立成分明確,效果穩(wěn)定的誘導方法,為以BMSCs為種子細胞的軟骨組織工程應用于臨床奠定基礎(chǔ),提供技術(shù)支持。
【圖文】：

‘卜國醫(yī)學于}學院北爾協(xié)和卜:學院整形外科醫(yī)院;PCR全!，!果{，:生刁、一揮，)!}交犯i幾(〔’ollj)平1!50四!]勺表達從開始培養(yǎng)到變化(}釗4)，從第3周開始有輕微的下降。一型膠原(Ct)I達很弱.但是隨才l培養(yǎng)的延長逐漸的增加!，〔到第4周。}一型膠原天是明顯增高少仁達到J’，宮J峰，，并在培養(yǎng)的過程中逐漸降低。

圖spGA/PLA復合材料支架外觀a:用」幾接種軟·{才細胞或成纖維細胞的支架(直徑12、二二.厚度21om)b:用」幾接種BMses的支架(直徑5，n，n，)‘J了度21n:二)F19.5Gx·055viewofPGA/PLAsea飾ldsa:Seaffoldfol·ellondroeytes(12x刀anindia一1飛etex..Zm一ninthiekness)b:SeaflbldforBMSCsfsmrni一飛dla一netel幾2111了nintlllckness、陰義、一材料復介物(J.4L.m月弓…

本文編號：2555830