【摘要】：哺乳動(dòng)物胚胎造血分為兩個(gè)階段,即原始造血和定向造血。原始造血起源于E7-7.5(embryonic day 7-7.5,E7-E7.5)的卵黃囊(yolk sac YS),以產(chǎn)生原始的有核紅細(xì)胞為主要特征;定向造血階段則主要開始于E10.5的主動(dòng)脈-中腎-生殖嵴(aorta-gonads-mesonephros,AGM)區(qū),主要以產(chǎn)生造血干細(xì)胞(hematopoietic stem cells, HSC)為主要特征,HSC具有自我更新能力,并可長(zhǎng)期重建致死劑量照射小鼠的造血系統(tǒng)。 目前,多數(shù)研究認(rèn)為原始造血起源于胚外的YS,而定向造血?jiǎng)t起源于胚內(nèi)AGM區(qū)。2005年,Orkin小組證實(shí)E10.5-E11.0小鼠胎盤也存在成體型HSC,E12.5時(shí),其數(shù)量有顯著擴(kuò)增。而早在1997年,Yoder小組的一系列研究則表明:E9.0的卵黃囊和主動(dòng)脈旁臟壁層(para-aortic splanchnopleura,P-Sp,)能夠重建經(jīng)白消安(busulfan)處理的新生小鼠的造血系統(tǒng),且具有自我更新能力,二次移植后能重建成體受體,這類特殊的HSC被稱為新生型HSC。1994年,Dzierzak等將E11(42體節(jié))的小鼠胚胎循環(huán)血移植入經(jīng)9.5Gy照射的成年小鼠,并未發(fā)現(xiàn)供體血細(xì)胞的嵌合。與之相反,Medvinsky等在之后的研究卻發(fā)現(xiàn)E11.5的小鼠胚胎循環(huán)血中存在HSC。同期,Orkin等也發(fā)現(xiàn)E11.5(41-45體節(jié))循環(huán)血能夠重建成體造血,但是嵌合比例很低(0.6%),直到E12.5才出現(xiàn)較高比例的嵌合。但是,Dzierzak等移植E11.5(45-48S)的胚胎循環(huán)血,移植劑量高達(dá)5個(gè)胚胎量(embryonic equivalent,ee),但最終均未見重建。最近的研究顯示:即使是在同一穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)條件下,相同小鼠品系,小鼠胚胎分期精確到體節(jié),CFU-Cs的活性檢測(cè)都存在較大差異�；谏鲜鲅芯考氨緦�(shí)驗(yàn)室的前期經(jīng)驗(yàn),我們認(rèn)為:就HSC的檢測(cè)系統(tǒng)而言,若干因素(如輻照總劑量和劑量率,受體鼠的大小和狀態(tài),細(xì)胞的分離消化時(shí)間等)的不同都可能影響最終的重建效率和嵌合比例。 綜上所述,關(guān)于小鼠胚胎循環(huán)血的造血潛能,尤其是是否存在HSC的問題仍存在很大爭(zhēng)議,且缺乏系統(tǒng)性研究。,本研究以小鼠胚胎循環(huán)血為重點(diǎn)研究對(duì)象,選擇HSC發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)間點(diǎn)(E10.5和E11.5),從造血標(biāo)志表達(dá)、CFU-C的形成、淋系分化、CFU-S8、HSC移植等多個(gè)方面對(duì)小鼠胚胎循環(huán)血的造血活性規(guī)律進(jìn)行了較全面和系統(tǒng)的研究。 我們分離小鼠胚胎循環(huán)血,免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)小鼠E11.5胚胎循環(huán)血中只有少量細(xì)胞表達(dá)CD45。相反,Ter119在多數(shù)細(xì)胞表達(dá),且通過DAPI染色確認(rèn)其具有細(xì)胞核,為原始紅細(xì)胞。流式分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn):小鼠胚胎循環(huán)血中CD45表達(dá)比例為0.9%,Ter119表達(dá)比例達(dá)到98.9%。小鼠胚胎循環(huán)血中Tie2和CD31表達(dá)均較低,分別為0.7%和1.1%,而c-Kit的表達(dá)為0.8%,上述結(jié)果提示小鼠胚胎循環(huán)血中可能含有造血前體細(xì)胞。將獲得的E10.5和E11.5小鼠胚胎循環(huán)血計(jì)數(shù)有核細(xì)胞,按照一定的胚胎量接種造血CFU-C,結(jié)果顯示:小鼠胚胎循環(huán)血的CFU-mix集落形態(tài)特殊,以紅系為主,且結(jié)合致密。而造血集落數(shù)目有如下三個(gè)特點(diǎn),第一,集落類型主要以CFU-mix為主,CFU-E和CFU-GM相對(duì)較少。第二,E11.5小鼠胚胎循環(huán)血中所含的造血集落無論是總數(shù)還是各種類型,其數(shù)量均比E10.5多五倍以上。第三,相同數(shù)量的循環(huán)血細(xì)胞,二者產(chǎn)生的CFU-E和CFU-mix的頻率相似,而CFU-GM卻差別顯著。與既往不同,我們發(fā)現(xiàn)E10.5小鼠的AGM區(qū)和循環(huán)血細(xì)胞均不能產(chǎn)生CFU-S8,而E11.5的AGM區(qū)和循環(huán)血細(xì)胞均能夠形成CFU-S8,但數(shù)量少,每個(gè)胚胎分別含有0.5個(gè)和0.17個(gè)。 另外,我們將E11.5循環(huán)血有核細(xì)胞接種于OP9基質(zhì)細(xì)胞上,于第8-10天收集懸浮細(xì)胞,進(jìn)行B細(xì)胞分化檢測(cè)。我們發(fā)現(xiàn),90%的懸浮細(xì)胞表達(dá)B220,80%的細(xì)胞表達(dá)CD19。表明小鼠胚胎循環(huán)血中含有B淋巴細(xì)胞前體或更早期的多潛能造血前體。將E10.5的循環(huán)血有核細(xì)胞接種于OP9-DL1基質(zhì)細(xì)胞上,第6天時(shí),CD44+/CD25+雙陽性細(xì)胞逐漸出現(xiàn),其比例為28.1%,但CD44-/CD25+單陽性細(xì)胞(DN3階段)較少。同時(shí),亦有CD4+/CD8-細(xì)胞出現(xiàn),比例為5.1%。第14天時(shí), CD44-/CD25+單陽性細(xì)胞比例增加至25.6%,并出現(xiàn)較成熟的CD4+/CD8+雙陽性細(xì)胞,比例為7.5%,CD3+/TCRαβ+雙陽性細(xì)胞的比例為3.6%。上述結(jié)果表明:盡管誘導(dǎo)效率稍低,小鼠E10.5胚胎循環(huán)血中存在具有T淋巴細(xì)胞潛能的造血前體細(xì)胞。 定向造血發(fā)育最核心的事件是HSC的產(chǎn)生。為明確小鼠胚胎循環(huán)血HSC的活性,我們采集E10.5(36-40體節(jié))、E11.5(41-50體節(jié))GFP轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎的循環(huán)血細(xì)胞進(jìn)行移植。移植后6-8周和6個(gè)月分別采集受體鼠的外周血進(jìn)行供體嵌合檢測(cè),計(jì)算GFP+CD45+/(GFP+CD45++GFP-CD45+)的比值得到嵌合率。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,我們視嵌合率≥10%時(shí)為重建成功。我們發(fā)現(xiàn)以E10.5的胚胎循環(huán)血作為供體(n=23),均未檢測(cè)到供體細(xì)胞在外周血的嵌合。以E11.5的胚胎循環(huán)血作為供體(n=20),3只受體造血重建,移植后6-8周時(shí)其外周血中的嵌合率分別為31.3%、34.5%、43.7%,6個(gè)月時(shí)為28.4%、48.8%、89.3%。該數(shù)據(jù)表明:E11.5小鼠胚胎循環(huán)血具有長(zhǎng)期、高效重建致死劑量照射小鼠造血系統(tǒng)的能力。為了考察小鼠胚胎循環(huán)血的各系重建能力,我們檢測(cè)了重建受體的外周血、骨髓、脾臟和胸腺的各系嵌合能力,結(jié)果表明:上述組織均能檢測(cè)到相當(dāng)比例的供體來源的髓系和淋系細(xì)胞。為驗(yàn)證上述造血細(xì)胞的自我更新能力,我們應(yīng)用已重建受體的骨髓細(xì)胞進(jìn)行二次移植,移植2個(gè)月后,取其外周血檢測(cè),發(fā)現(xiàn)嵌合率均低于10%,分別為1.1%、2.8%、1.8%,而平行組的AGM區(qū)則有相當(dāng)比例的嵌合。這表明,與AGM區(qū)相比,同期循環(huán)血中的HSC自我更新能力較差。綜上所述:早期的小鼠胚胎循環(huán)血細(xì)胞表達(dá)造血標(biāo)志,可以在體外形成CFU-C,E11.5時(shí)含有CFU-S8,且移植后能重建成體小鼠骨髓造血的各個(gè)譜系。然而,其自我更新能力較弱,表明此時(shí)在胚胎循環(huán)中遷移的HSC其功能并未完全成熟。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

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1 李專;賀文艷;李韌;陳冬波;張毓;劉兵;;應(yīng)用OP9/OP9-DL1闡明小鼠8.5天胚胎的淋系潛能[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志;2010年05期

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本文編號(hào)：2552684