【摘要】：第一部分:Beagle犬脂肪干細(xì)胞原代培養(yǎng)及誘導(dǎo)成肌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究 目的:驗(yàn)證犬脂肪干細(xì)胞(ADSCs)原代培養(yǎng)及誘導(dǎo)成肌細(xì)胞方法的可行性,并為肌性管腔的構(gòu)建提供可靠的種子細(xì)胞。 方法:取雄性Beagle犬腹股溝處皮下脂肪組織,使用酶消化法行原代脂肪干細(xì)胞培養(yǎng),并對所培養(yǎng)的ADSCs表面標(biāo)志進(jìn)行流式細(xì)胞儀鑒定;取第1代培養(yǎng)至對數(shù)生長期細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組A和對照組B兩組,誘導(dǎo)劑為10umol/L的5-aza,每日倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,并在誘導(dǎo)的第7,14,21,28天行細(xì)胞免疫熒光和流式細(xì)胞儀檢測其特異性成肌細(xì)胞特異性抗原desmin和myosin的表達(dá)情況。 結(jié)果:成功從犬腹股溝部皮下脂肪組織分離、培養(yǎng)出ADSCs,相關(guān)表面抗原表達(dá)檢測證實(shí)其干細(xì)胞特性。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化顯示:誘導(dǎo)組細(xì)胞誘導(dǎo)3周出現(xiàn)成肌細(xì)胞特有的“漩渦”樣生長形態(tài),在誘導(dǎo)的第4周單個細(xì)胞表現(xiàn)出多核化;免疫熒光和流式細(xì)胞儀檢測顯示:desmin和myosin的表達(dá)率在誘導(dǎo)28天時達(dá)最高,分別為59.4%和56.1% ,而誘導(dǎo)前和對照組細(xì)胞均呈陰性表達(dá)。 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了脂肪干細(xì)胞可通過誘導(dǎo)向成肌細(xì)胞方向分化,為下一步實(shí)驗(yàn)提供了可靠的種子細(xì)胞。 第二部分:Beagle犬上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定的實(shí)驗(yàn)研究 目的:探討犬上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)方法的可行性,并為尿路肌性管腔粘膜上皮提供可靠的種子細(xì)胞。 方法:取雄性Beagle犬口腔黏膜上皮組織,使用酶消化法行上皮細(xì)胞原代培養(yǎng),使用3T3細(xì)胞作為細(xì)胞飼養(yǎng)層,細(xì)胞生長至培養(yǎng)皿80%左右行傳代處理;每日倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化;取第一代生長至對數(shù)期細(xì)胞行細(xì)胞免疫熒光和流式細(xì)胞儀鑒定表皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白AE1/AE3的表達(dá)情況。 結(jié)果:上皮細(xì)胞生長較緩慢,原代需培養(yǎng)20天方能達(dá)到100mm培養(yǎng)皿的80%左右,傳代后生長速度明顯加快,一般10天就能達(dá)到100mm培養(yǎng)皿的80%;細(xì)胞鑒定采用國際上上皮類組織比較常用的AE1/AE3來鑒定,熒光及流式結(jié)果讓人滿意。 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了上皮細(xì)胞可通過原代培養(yǎng)獲得,可作為下一步實(shí)驗(yàn)可靠的種子細(xì)胞。
【圖文】：

3 結(jié)果3.1 光鏡下細(xì)胞形態(tài)記錄：ADSCs原代培養(yǎng)48小時后可觀察到少量貼壁細(xì)胞， 72小時可見更多細(xì)胞貼壁并呈現(xiàn)“集落樣生長”（圖1）。取誘導(dǎo)前及空白組培養(yǎng)1周的ADSCs細(xì)胞光鏡觀察可見細(xì)胞呈短梭形，，40倍光鏡下可見細(xì)胞分布均勻、形態(tài)較一致,高倍鏡下見細(xì)胞呈短梭形、單核（圖2、圖3）。取培養(yǎng)3周的A組細(xì)胞光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，可及A組中“成肌細(xì)胞”在3周時增多，細(xì)胞初步呈現(xiàn)“漩渦狀”生長（圖4），同時期B組細(xì)胞變化不大（圖5）；取培養(yǎng)4周的A組細(xì)胞光鏡下可及細(xì)胞“漩渦狀”生長更明顯，并呈現(xiàn)成肌細(xì)胞的“多核化現(xiàn)象”（圖6）。3.2 流式細(xì)胞儀ADSCs細(xì)胞鑒定：取培養(yǎng)至第1代處于對數(shù)生長期細(xì)胞行干細(xì)胞相關(guān)指標(biāo)CD90和CD105鑒定，行CD34鑒定排除造血干細(xì)胞污染，結(jié)果示：高表達(dá)CD90和CD105

圖1原代培養(yǎng)48小時的ADSCs40倍光鏡圖 圖2.第一代培養(yǎng)7天的ADSCs100倍光鏡（primary culturefor 48 h ( ×40)） 圖（passage 1 for 5 days（×100））圖3. 第一代培養(yǎng)7天的ADSCs細(xì)胞200倍 圖4.A組培養(yǎng)3周的細(xì)胞100倍光鏡圖光鏡圖（passage 1 for 5 days（×200）） （Agroup cells induction for 3weeks ( ×100)）
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R329;R699.6

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本文編號：2552898