【摘要】：研究背景與目的： 外膜蛋白與H.pylori的定植、胃黏膜的損傷、炎性介質(zhì)的分泌和中性粒細(xì)胞的浸潤等有著密切關(guān)系，同時它是激發(fā)免疫反應(yīng)的主要成份，可誘導(dǎo)強大的菌株特異性免疫反應(yīng)，這在H.pylori的致病中起重要作用。H.pylori感染后的轉(zhuǎn)歸主要受細(xì)菌因素、宿主因素和環(huán)境因素三者的影響，其中細(xì)菌因素在H.pylori感染結(jié)局的多樣性中起重要作用，H.pylori毒力因子的基因多態(tài)性也是重要原因。以往對H.pylori毒力的研究多集中在尿素酶、細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白（Cag）、空泡毒素（VacA）等方面上，而近年來的研究發(fā)現(xiàn)H.pylori外膜蛋白與其定植、炎性介質(zhì)的分泌、胃黏膜的損傷和中性粒細(xì)胞的浸潤等有著密切關(guān)系。為了研究H.pylori疫苗的候選抗原成分和更好的防治H.pylori感染，本文將構(gòu)建H.pylori外膜蛋白唾液酸結(jié)合黏附素（SabA）的重組質(zhì)粒并檢測其體外表達(dá)重組蛋白的抗原性和分析來自江西臨床H.pylori菌株的前炎性外膜蛋白A(outerinflammatory protein A, OipA)、血型抗原結(jié)合黏附素(blood-group antigenbindingadhesion, BabA)、唾液酸結(jié)合黏附素(sialic acid-binding adhesion, SabA)的基因序列特征，并與來自東亞和非東亞地區(qū)的22株H.pylori的序列進行比對，分析不同區(qū)域的序列特征。探明我國外膜蛋白的基因特征對于研究其與疾病的關(guān)系具有重要意義以及為SabA作為靶抗原的研究奠定了基礎(chǔ)。 方法： 1.幽門螺桿菌唾液酸結(jié)合黏附素的克隆表達(dá)： （1）以H.pylori26695株基因組為模板，設(shè)計sabA基因特異性引物擴增目的基因； （2）將PCR產(chǎn)物插入到pGEX-4T-1載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達(dá)； （3）表達(dá)蛋白經(jīng)飛行質(zhì)譜鑒定，并用免疫印跡法評價其抗原性。 2.幽門螺桿菌外膜蛋白（OipA、BabA、SabA）的基因序列特征分析： （1）對前期分離的154株臨床H.pylori菌株進行復(fù)蘇培養(yǎng)，并提取其基因組DNA； （2）針對H.pylori外膜蛋白（OipA、BabA、SabA）設(shè)計多對特異性全長測序引物； （3）進行目的基因的擴增，并將其產(chǎn)物送于公司測序； （4）利用生物信息學(xué)軟件MEGA、AlignX、ClustalX2和相關(guān)信息數(shù)據(jù)庫進行DNA序列、氨基酸序列比對，分析江西地區(qū)的序列特征。 （5）將江西臨床菌株序列與來自不同區(qū)域的22株H.pylori菌株序列進行比對，分析不同區(qū)域的序列特征，找出江西地區(qū)菌株序列的特異性。 結(jié)果： 1.幽門螺桿菌唾液酸結(jié)合黏附素的克隆表達(dá)結(jié)果： （1）獲得H.pylori26695的唾液酸黏附素基因，并經(jīng)酶切鑒定基因sabA成功插入到pGEX-4T-1載體中。 （2）重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-sabA在大腸桿菌BL21中表達(dá)，經(jīng)飛行質(zhì)譜鑒定為幽門螺桿菌外膜蛋白SabA，且該蛋白具有抗原性。 2.幽門螺桿菌外膜蛋白（OipA、BabA、SabA）的基因序列特征分析結(jié)果： （1）擴增出臨床菌株外膜蛋白的OipA、BabA、SabA三個基因，且多對引物PCR的三個基因陽性率均為100%。根據(jù)DNA序列翻譯成氨基酸的方法，預(yù)測外膜蛋白OipA的蛋白質(zhì)表達(dá)陽性率為99.33%，BabA和SabA的蛋白質(zhì)表達(dá)陽性率分別為75.89%和61.90%。babA基因序列有52.43%的堿基位點發(fā)生突變明顯高于sabA基因序列的49.28%，而翻譯成的氨基酸序列后，babA氨基酸序列有42.38%的氨基酸位點發(fā)生突變明顯低于sabA氨基酸序列的46.96%，說明babA的堿基位點突變多數(shù)為同義突變，DNA序列的變化不影響氨基酸的變化。 （2）DNA序列比對聚類分析結(jié)果： ①oipA基因中有257個堿基點發(fā)生了突變，占基因全長的27.81%，與不同地區(qū)的菌株序列比對發(fā)現(xiàn)江西地區(qū)的菌株序列CT重復(fù)數(shù)不明顯。將序列聚類可分為七大類，其中來自非東亞地區(qū)的菌株序列聚為一個小類，而來自東亞地區(qū)的菌株序列卻分別與江西菌株序列聚為不同的小類。 ②babA基因中有1209個位點堿基發(fā)生突變，占基因全長的52.43%，比對發(fā)現(xiàn)babA整個基因基因序列在600～1100位點存在一個高突變區(qū)域。將序列聚類大致可以分為兩類，其中來自非東亞地區(qū)的菌株序列聚為一個類別，而來自韓國的菌株序列卻聚為一個小類，來自日本的菌株序列分別與江西菌株序列聚為不同的小類。 ③sabA基因中有1021個堿基位點發(fā)生了突變，占全長基因的49.28%，比對發(fā)現(xiàn)sabA整個基因序列在0～100、200～1200位點存在兩個高突變區(qū)，與不同地區(qū)的菌株序列比對發(fā)現(xiàn)江西臨床菌株序列不存在CT重復(fù)序列。將其聚類可以分為兩個大類，來自東亞地區(qū)的菌株序列與江西菌株序列聚為不同的小類。 （3）氨基酸序列比對聚類分析結(jié)果： ①oipA氨基酸序列中有81個位點氨基酸發(fā)生了突變，占全長氨基酸序列的26.30%，其等電點在9.42～10.03之間，平均值為9.62；不穩(wěn)定指數(shù)在16.12～23.81之間，平均值為18.91；脂肪指數(shù)在77.30～82.11，平均值為79.73；親水值在－0.385～－0.255之間，平均值為－0.341。將所有推測出的氨基酸序列進行比對聚類分析，此聚類圖顯示根據(jù)氨基酸的變化將氨基酸序列大致分為七類，和DNA序列聚類是對應(yīng)的。 ②babA的氨基酸序列中有317個位點氨基酸發(fā)生了突變，占全長氨基酸序列的42.38%，其等電點在6.15～11.00之間，平均值為9.18；不穩(wěn)定指數(shù)在－1.86～43.61之間，平均值為21.59；脂肪指數(shù)在0～92.08，平均值為67.21；親水值在－1.575～0.020之間，平均值為－0.426。將所有推測出的氨基酸序列進行比對聚類分析，大致可以分為三個大類，其中142號菌株的氨基酸序列和其他菌株的氨基酸序列有著很大的差異性。 ③sabA的氨基酸序列中有1021個位點氨基酸發(fā)生了突變，占全長氨基酸序列的46.96%，其等電點在4.93～12.31之間，平均值為9.29，不穩(wěn)定指數(shù)在7.66～62.90之間，平均值為31.37；脂肪指數(shù)在71.78～149.41，平均值為90.60；親水值在－0.761～1.200之間，平均值為－0.181。將所有推測出的氨基酸序列進行比對聚類分析，，大致可以分類兩個大類。 結(jié)論： 1.成功克隆了H.pylori的SabA，并能在大腸桿菌BL21中表達(dá)，該蛋白具有良好的抗原性。 2.我國臨床菌株序列的oipA、babA和sabA DNA序列檢測的陽性率明顯高于其他國家和地區(qū)。 3.序列比對聚類發(fā)現(xiàn)我國臨床菌株序列存在著多態(tài)性，不同地區(qū)的菌株序列有著不同的特征，而我國菌株序列與東亞地區(qū)比較接近，與非東亞地區(qū)差異比較大。
【圖文】：

4圖 2.1 表達(dá)質(zhì)粒 pGEX-4T-1 物理圖譜Figure 2.1 Expression plasmid pGEX-4T-1 physical mapamH I 和 Xho I TaKaRa 公司(China)DNA 連接酶 TaKaRa 公司(China)i BL21(DE3) 天根生化科技有限公、dNTP 天根生化科技有限公 天根生化科技有限公天根生化科技有限公PTG 天根生化科技有限公i Plasmid Kit 天根生化科技有限公

圖 2.2 PCR 產(chǎn)物凝膠電泳分析dder Marker；2：陰性對照；3：PCR 擴增 sabA 產(chǎn)物gure 2.2 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR prodder Marker；2: Negative control；3: sabA of PCR produc粒的酶切鑒定 pGEX-4T-1-sabA 經(jīng) BamHⅠ和 XhoⅠ雙酶切的條帶，分別約為 4 969bp（pGEX-4T-1）和 1圖 2.3），證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R378

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本文編號：2552405