【摘要】：硒是人和動物體必需的微量元素之一,具有多種重要生理功能。我國一些地區(qū)早先發(fā)生的克山病和大骨節(jié)病就是由于當?shù)鼐用耖L期攝硒不足而導致的。硒的有益性和致毒性之間的濃度界限很窄,建立靈敏度高、準確可靠的硒元素分析方法具有重要的現(xiàn)實意義。硒在動物體內(nèi)主要通過與蛋白結(jié)合的形式來發(fā)揮它的功能性,分析鑒定含硒的蛋白可以使我們更好地了解硒對人體健康的影響機理。 本文建立了微波消解-氫化物原子熒光光譜法(MD-HG-AFS)和微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(MD-ICP-MS)兩種硒含量分析方法,并對其進行了比較分析。兩種方法在各自定量限上均能獲得準確可靠的分析結(jié)果。MD-HG-AFS法樣品處理相對繁瑣,工作效率低,但在在試驗成本上占據(jù)一定優(yōu)勢,利于普及推廣。MD-ICP-MS法所需儀器昂貴,但樣品制備簡便快速,線性范圍寬,檢測靈敏度比前者高約20倍,分析速度快,適于大批量樣品的多元素高通量分析。 在硒元素的形態(tài)分析上,建立了在線分離測定硒代胱氨酸(Se-Cys)和硒代蛋氨酸(Se-Met)的液相色譜-電感耦合等離子質(zhì)譜法(LC-ICP-MS)和液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-ESI-MS-MS). LC-ICP-MS法中,Se-Cys和Se-Met在1-100μg/L均線性良好,兩者的檢出限分別為0.576μg/L和0.839μg/L,精密度試驗中RSD值10%,該方法能夠滿足快速檢測Se-Cys和Se-Met含量的要求；LC-ESI-MS-MS法在優(yōu)化條件下Se-Cys(定量子離子為248.1)和Se-Met(定量子離子為181.1)在2-100μg/L均線性良好,檢出限分別為0.92μg/L和0.95μg/L。兩種方法都能夠應用于硒元素的形態(tài)分析,但前者在實際樣品分析中基質(zhì)干擾小,適于定量分析,而后者的定性分析則更加可靠,還可用于鑒定未知的含硒化合物,兩種方法優(yōu)勢互補。 水產(chǎn)品中含有豐富的硒,采用已建立的分析方法對23種水產(chǎn)品中的硒含量進行了分析,最終以泥鰍為研究對象進一步分析。采用順序提取法,依次對泥鰍肌肉中的水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、醇溶性蛋白和堿溶性蛋白進行了提取。結(jié)果未提到醇溶性蛋白,其它三者含量的相對百分比依次為堿溶性蛋白(63.27%)水溶性蛋白(24.44%)鹽溶性蛋白(12.29%)。粗蛋白的分離純化研究對比了兩種陰離子交換填料(DEAE-Sephacel和DEAE sepharose FF),最終選用DEAE-Sephacel對粗蛋白提取物進行了初步分離純化。經(jīng)分離,從水溶性蛋白得到了W-1、W-2等六種蛋白組分；堿溶性蛋白分離得到了A-1、A-2等四個蛋白組分。采用SDS-PAGE分析,結(jié)果顯示提取得到的蛋白樣品分子量集中于4.1-66 kDa。由水溶性蛋白收集的六個組分中,W-5和W-6相對較純,分子量分別處于35 kDa和20 kDa附近。W-1和W-2、W-3和W-4的分離效果欠佳,分別含有共同的蛋白組分。 硒在不同蛋白組分中分布情況的研究表明,三種蛋白粗提物中均含有一定的硒含量,含硒量依次為水溶性蛋白(1.866μg/g)堿溶性蛋白(1.801μg/g)鹽溶性蛋白(1.607μg/g)；結(jié)合各蛋白粗提物的提取得率,可知蛋白硒占總硒的57.62%,可見硒在泥鰍肌肉中主要以與蛋白結(jié)合的形式存在,其中水溶性蛋白的W-4組分硒含量最高,為1.278μg/g。硒在泥鰍蛋白中的賦存形態(tài)研究中,對樣品的水解條件進行了優(yōu)化,證實酶解處理蛋白樣品效果均好于鹽酸水解,幾種酶解方式中Ⅻ(胰蛋白酶+風味蛋白酶)的酶解效果最好。將LC-ICP-MS法和LC-ESI-MS-MS法結(jié)合分析證實,Se-Met是硒在所有蛋白樣品中的唯一賦存形態(tài)。 采用膠內(nèi)酶解處理、基質(zhì)輔助激光解吸飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜分析方式對硒含量相對較高的水溶性蛋白組分W-4進行了分析鑒定。檢索結(jié)果表明,匹配度較高的三種蛋白均屬于肌肉組織中肌酸激酶。
【圖文】：

HN03一HZO:消解體系，用量分別為 4mL和 2mL。傳統(tǒng)的濕法消解常需要冷消化過夜，效率較低，，本法樣品采用密閉式微波消解，由消解罐的數(shù)量選擇相應的功率，優(yōu)化了2.2.1梯度升溫程序下終溫的保持時間(圖2一l)，可知15一 30min內(nèi)各樣品測定值己基木保持穩(wěn)定，表明180℃下 15min樣品即可消解完全，且測定干擾小，結(jié)果重現(xiàn)性好。06r蝦蟹螺蛤龍魚魚子小魷花梭黑田

本文編號：2550234