【摘要】：在過去幾十年的脂質(zhì)體有各種醫(yī)療應(yīng)用，包括分子成像，藥物輸送，以及靶向性治療。脂質(zhì)體表面積大，結(jié)構(gòu)具有彈性，有很大的修飾改良的潛力，其在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)出獨(dú)特的性質(zhì)。傳統(tǒng)脂質(zhì)體易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，通過EPR效應(yīng)實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向到肝臟，肺等特定組織；長循環(huán)脂質(zhì)體經(jīng)過高親水雙性分子的修飾，使得脂質(zhì)體能夠逃避RES的吞噬，延長其在血液中的循環(huán)時(shí)間，增加藥物釋放時(shí)間和作用時(shí)間，但缺乏靶向性，需要對(duì)脂質(zhì)體表面進(jìn)行額外的靶向配體修飾。目前，針對(duì)淋巴細(xì)胞的的靶向脂質(zhì)體研究甚少，而在多種疾病中，治療的失敗往往是由于淋巴系統(tǒng)中隱匿的病灶，由于淋巴系統(tǒng)不同于其他身體器官，使得常規(guī)脂質(zhì)體不能達(dá)到有效藥物劑量，又或者因?yàn)橄拗菩远拘圆荒苓_(dá)到治療效果。本研究的重點(diǎn)是采用人工篩選的靶向配體多肽或者由免疫細(xì)胞自身剪切的多肽，對(duì)淋巴細(xì)胞形成靶向，構(gòu)建淋巴系統(tǒng)靶向的脂質(zhì)體，使其特異性的作用于淋巴細(xì)胞，達(dá)到治療或者預(yù)防的效果。 在人工篩選多肽配體的脂質(zhì)體研究中，我們根據(jù)CD40/CD40L這一對(duì)與自身免疫疾病相關(guān)的通路，針對(duì)CD40L設(shè)計(jì)多肽配體，期望借助這配體實(shí)現(xiàn)對(duì)CD40/CD40L信號(hào)通路的阻斷，同時(shí)對(duì)此通路中過度活躍的T細(xì)胞實(shí)現(xiàn)靶向殺傷。而隱形脂質(zhì)體作為多肽配體展示以及細(xì)胞毒性藥物的載體已經(jīng)有大量的研究，我們結(jié)合篩選到的特異性配體，輔以細(xì)胞毒性藥物，使用脂質(zhì)體作為兩者的載體，使其同時(shí)能夠完成通路阻斷和T細(xì)胞靶向殺傷的效果。 我們使用計(jì)算機(jī)輔助模擬，確定受體和配體作用位點(diǎn)，篩選出具有與配體結(jié)合潛能的候選肽。后續(xù)使用表面等離子共振技術(shù)，對(duì)計(jì)算機(jī)虛擬篩選得到的候選多肽進(jìn)行分子層面篩選。如此得到的多肽，我們?cè)龠M(jìn)行細(xì)胞層面的結(jié)合力篩選，最終確定個(gè)靶向多肽來進(jìn)行CD40L+T細(xì)胞靶向毒性的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此多肽修飾的脂質(zhì)體確實(shí)可以介導(dǎo)體外CD40L+T細(xì)胞的靶向殺傷，同時(shí)在對(duì)CD40/CD40L信號(hào)通路過度活化造成的動(dòng)物疾病模型的治療中，多肽修飾的脂質(zhì)體與非靶向脂質(zhì)體相比也表現(xiàn)出了較好的治療效果。 在天然表位肽制備脂質(zhì)體的研究中，我們利用抗原呈遞細(xì)胞中MHC-II類分子呈遞抗原的過程，將抗原蛋白自然剪切成T細(xì)胞表位多肽。目前的研究，只能通過人工洗脫得到這些肽段或者計(jì)算機(jī)模擬后經(jīng)過化學(xué)合成得到表位肽，費(fèi)時(shí)費(fèi)錢。而我們的研究則將此天然剪切的T細(xì)胞表位肽作為整體，通過脂質(zhì)體重新組裝抗原呈遞細(xì)胞上含有MHC-II分子和表位肽的膜片段，考察這復(fù)雜的黑箱系統(tǒng)是否能對(duì)下游T細(xì)胞進(jìn)行活化，引起機(jī)體的免疫反應(yīng)。由于脂質(zhì)體是膜蛋白的良好載體，所以使用脂質(zhì)體可以很好的保持MHC-II分子和表位肽的生物活性，同時(shí)脂質(zhì)體還是個(gè)類細(xì)胞系統(tǒng)，使得其裝載細(xì)胞膜片段后能夠?qū)崿F(xiàn)部分膜蛋白的功能。 在此項(xiàng)研究中，我們使用OVA作為模式抗原蛋白，樹突狀細(xì)胞作為模式抗原呈遞細(xì)胞，通過體外活化的方法使得OVA經(jīng)過自然剪切產(chǎn)生OVA表位肽，而此表位肽是與樹突狀細(xì)胞上的MHC-II分子結(jié)合在一起的。后續(xù)提取這表位肽/MHC-II復(fù)合物，利用脂質(zhì)體作為載體，制成靶向CD4+T細(xì)胞的表位肽免疫脂質(zhì)體。該脂質(zhì)體在體外可以促進(jìn)MF2.2D9T細(xì)胞株分泌IL-2，并且誘導(dǎo)原代CD4+T細(xì)胞增殖。將其回輸體內(nèi)，可以引起OVA特異性的體液免疫。經(jīng)此脂質(zhì)體免疫后的小鼠，可具有針對(duì)OVA的抗腫瘤特性，經(jīng)分析該抗腫瘤效果是體液免疫和細(xì)胞免疫的共同作用結(jié)果。說明我們制備的自然剪切的表位肽T細(xì)胞靶向脂質(zhì)體保持了定免疫學(xué)活性，并且可以作為種預(yù)防性腫瘤疫苗使用。
【圖文】：

細(xì)胞在進(jìn) 步的成熟和分化過程中，因?yàn)樗幁h(huán)境不同通過各種細(xì)胞因子介導(dǎo)控分化成不同的細(xì)胞亞類型。CD4+ T 細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞相互作用時(shí)，經(jīng)過個(gè)信號(hào)通路（TCR/MHC 以及 CD28/B7）的刺激，進(jìn)入細(xì)胞因子和相應(yīng)的細(xì)胞因受體低表達(dá)的狀態(tài)。最終這些細(xì)胞因子所形成的微環(huán)境決定細(xì)胞分化成那種亞胞類型。通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和活化轉(zhuǎn)錄分子 4（STAT4）的激活作用，（白介素 12）12 會(huì)加強(qiáng)干擾素γ（IFN-γ）的產(chǎn)生，然后再通過 STAT1，增加了轉(zhuǎn)錄因子 T-的表達(dá)。而 T- bet 又會(huì)增加 IL-12 和 IFN-γ的表達(dá)，抑制 IL-4 的表達(dá)，最使得 T 細(xì)胞朝著 Th1 亞細(xì)胞類型分化。在另外 種情況下，IL-4 通過 STAT加 GATA 結(jié)合蛋白 3 (GATA3) 的表達(dá)，GATA3 又會(huì)增強(qiáng) IL-4 的表達(dá)，抑制的表達(dá)，最后使得最終使得 T 細(xì)胞分化為 Th2 亞細(xì)胞類型。如圖 1（圖片來源維基百科網(wǎng)頁）所示，CD4+ T 細(xì)胞最終分化成 Th1 和 Th2 亞細(xì)胞群，而這兩細(xì)胞又行使著不同的免疫學(xué)功能[2]。

博士學(xué)位論文般說來， 個(gè)初始 CD8+ T 細(xì)胞能產(chǎn)生約 10000 個(gè)子細(xì)胞。這些新生的細(xì)胞表現(xiàn)出不同的效應(yīng)功能，如分泌細(xì)胞因子或具有細(xì)胞毒作用。但這些細(xì)胞的存在是較為短暫的，有 90-95％在擴(kuò)張階段后很快死亡。其余 5-10％的 CD8+ T 細(xì)胞存活壽命較長，是記憶型 CD8+ T 細(xì)胞[18]。這些記憶 CD8+ T 細(xì)胞還分布在外周組織中，，它們可以作為效應(yīng)細(xì)胞之外，還組成供針對(duì)病原體再次感染的第 防線。它們可以以非抗原依賴型的模式迅速的募集到炎癥部位，對(duì)攜帶同源抗原的病原體進(jìn)行的抵抗，保護(hù)機(jī)體。1.3 T 細(xì)胞活化通路
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392

【共引文獻(xiàn)】

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1 Mariangela Ricotta;Maura Iannuzzi;Giulia De Vivo;Vittorio Gentile;;Physio-pathological roles of transglutaminase-catalyzed reactions[J];World Journal of Biological Chemistry;2010年05期

2 熊素彬;崔冬梅;王文喜;謝其冰;幸浩洋;;類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的靶向給藥系統(tǒng)研究進(jìn)展[J];中國藥學(xué)雜志;2012年01期

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1 陳群;木瓜苷對(duì)大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎的作用及其與滑膜細(xì)胞G蛋白偶聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)系[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2003年

2 李海波;基于多亞單位Th表位的幽門螺桿菌疫苗的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2013年

3 劉玉濤;TGM6轉(zhuǎn)基因小鼠模型的構(gòu)建和鑒定[D];中南大學(xué);2013年

本文編號(hào)：2550337