【摘要】：2005年科學(xué)家Allander利用PCR技術(shù),通過(guò)借助信息學(xué)相關(guān)方法對(duì)嬰幼兒鼻咽分泌物樣本進(jìn)行大范圍排查,發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)新型細(xì)小病毒,即人博卡病毒(HumanBocavirus, HBoV)。 HBoV是一種直徑約為18-25nm,無(wú)囊膜,單鏈線性DNA病毒,基因組大小約為5300nt,其外包被著T=1的二十面體的蛋白衣殼,以保護(hù)DNA不受外界環(huán)境如高溫、PH變化、高鹽等影響。感染HBoV的患者外表癥狀多為發(fā)燒、咳嗽、喘息等下呼吸道感染癥狀,少數(shù)病情嚴(yán)重者出現(xiàn)呼吸窘迫的現(xiàn)象。HBoV屬于細(xì)小病毒科,細(xì)小病毒亞科,博卡病毒屬。 HBoV基因組含有兩個(gè)主要開(kāi)放閱讀框,一個(gè)編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NP1,另一個(gè)則轉(zhuǎn)錄翻譯兩個(gè)衣殼蛋白VP1和VP2; VP1的5’端獨(dú)特區(qū)VP1-Unique序列具有磷脂酶A2活性,這種活性與病毒的感染性有關(guān),已有的一些資料表明,基因組中編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的區(qū)域比較保守,而變化的部分位于編碼核衣殼蛋白的區(qū)域；在基因組DNA的3’端和5’端分別存在一個(gè)末端反向重復(fù)序列(Inverted terminal repeat, ITR),其會(huì)形成反轉(zhuǎn)回文結(jié)構(gòu),細(xì)小病毒DNA復(fù)制時(shí)是以該末端兩部分反轉(zhuǎn)互補(bǔ)的回折部分作為的引物。 本研究依據(jù)人博卡病毒基因序列(GeneBank:GU139423)設(shè)計(jì)VP1抗原表位區(qū)域(4160-4480nt)的引物,通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因,并將擴(kuò)增的片段插入到質(zhì)粒pET-49b (+)中,通過(guò)IPTG誘導(dǎo)融合蛋白,并用切膠純化的方法切取融合蛋白,研磨并用PBS溶解,之后將制備的融合蛋白樣免疫小鼠,最終得到VP1多克隆抗體,為今后研究人博卡病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2的功能奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 同時(shí),為了弄清楚人博卡病毒VP1、VP2以及NS1蛋白在細(xì)胞中的分布情況,本實(shí)驗(yàn)還將這幾個(gè)蛋白的基因分別克隆到真核表達(dá)載體pEGFP系列上,并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞293T細(xì)胞中,觀察VP1、VP2以及NS1蛋白在細(xì)胞中的定位分布。然而,在研究蛋白定位的同時(shí),本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將pEGFP-n1-NP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入HeLa細(xì)胞后,細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡的現(xiàn)象,并且在之后利用DAPI染色與Capsase活性檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)對(duì)這一現(xiàn)象做了進(jìn)一步的確認(rèn)。
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類(lèi)號(hào)】：R373

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本文編號(hào)：2549726