【摘要】：目的探討轉(zhuǎn)染外源性基因GATA-4促進(jìn)5-氮雜胞苷(5-azacytidine,5-aza)誘導(dǎo)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向心肌細(xì)胞分化的作用。方法全骨髓法分離大鼠BMSCs,按照1∶2.5比率用脂質(zhì)體法將GATA-4(pVP22-GATA-4/myc-His)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染第3代BMSCs,轉(zhuǎn)染72 h后加入10μmol/L 5-aza誘導(dǎo)24 h,觀察細(xì)胞形態(tài)變化。轉(zhuǎn)染48 h后,免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)GATA-4、myc的表達(dá)。于誘導(dǎo)后28 d免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫印跡法檢測(cè)GATA-4、心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)的表達(dá)情況,以鑒定細(xì)胞分化。結(jié)果轉(zhuǎn)染72 h后,免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組可見GATA-4、myc表達(dá)。誘導(dǎo)后28 d應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組GATA-4、cTnT表達(dá)顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論外源表達(dá)GATA-4能夠促進(jìn)5-aza誘導(dǎo)的BMSCs向心肌分化。
【圖文】：

锨浚?24h后，少量BMSCs開始貼壁;72h后，大多數(shù)細(xì)胞已貼壁，貼壁細(xì)胞逐漸伸展呈多角形、紡錘形、圓形。原代培養(yǎng)中，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)是以克隆集落的方式增殖。3～4d可見小的集落形成。7～14d，相鄰集落匯合成片達(dá)80%以上，呈旋渦狀或放射狀排列，此時(shí)可進(jìn)行第1次傳代。傳代培養(yǎng)的細(xì)胞于2～4h開始貼壁，24h內(nèi)貼壁完全，形態(tài)與原代細(xì)胞相似，3～5d即可達(dá)到匯合，可以繼續(xù)傳代。第3代BMSCs形態(tài)基本單一，呈梭形的成纖維細(xì)胞狀，細(xì)胞排列成漩渦狀或放射狀(圖1)。圖1第3代大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(×200)Figure1ThethirdgenerationofBMSCs(×200)2．2外源性基因GATA-4轉(zhuǎn)染BMSCs及表達(dá)鑒定脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后，BMSCs可見漂浮的死亡細(xì)胞，48h達(dá)高峰，之后死亡細(xì)胞數(shù)減少，細(xì)胞恢復(fù)活力，開始增殖，，于轉(zhuǎn)染后72h，可匯合生長(zhǎng)至80%～90%。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)法計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率，發(fā)現(xiàn)當(dāng)質(zhì)粒DNA(μg)和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000(μL)的比率為1∶2．5時(shí)，轉(zhuǎn)染效率最高，故后續(xù)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)均采用1∶2．5的體系比例。進(jìn)行轉(zhuǎn)染后48h，取細(xì)胞爬片的BMSCs做免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示GATA-4(細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá))和myc蛋白(胞核胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá))的表達(dá)情況，結(jié)果顯示有部分棕黃色陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞(圖2)，說(shuō)明有GATA-4和myc蛋白的表達(dá)，即成功地將pVP22-GATA-4/myc-His質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入BMSCs，轉(zhuǎn)染效率約為30%。空質(zhì)粒組和對(duì)照組均無(wú)陽(yáng)性結(jié)果。圖2BMSCs轉(zhuǎn)染后48hGATA-4、myc的陽(yáng)性表達(dá)(免疫細(xì)胞化學(xué)染色×200)A．GATA-4胞核陽(yáng)性;B．myc胞核胞質(zhì)陽(yáng)性Figure2GATA-4，mycpositi
【作者單位】： 河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院
【基金】：河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(QN2016159) 河北省大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(USIP2017034)
【分類號(hào)】：R541

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本文編號(hào)：2549592