【摘要】：蛋白質(zhì)是組成生物體的基本物質(zhì),維持其新陳代謝活動(dòng)的正常進(jìn)行。蛋白質(zhì)構(gòu)造和功效的研究及定量分析將為我們研究生命在不同條件下的變化機(jī)制奠定基礎(chǔ),同時(shí)也對(duì)臨床醫(yī)學(xué)、生命科學(xué)及藥物化學(xué)等學(xué)科的發(fā)展具有重要的意義。蛋白質(zhì)標(biāo)記熒光探針日益廣泛地應(yīng)用于生物分析、蛋白質(zhì)組學(xué)中的識(shí)別、結(jié)構(gòu)變化的研究及各項(xiàng)生理活動(dòng)指標(biāo)檢測(cè)等。因此開(kāi)發(fā)新型蛋白質(zhì)標(biāo)記熒光探針、建立選擇性好、靈敏度高的蛋白質(zhì)定量檢測(cè)分析方法已成為臨床醫(yī)學(xué)、生物化學(xué)及生命科學(xué)等學(xué)科研究人員共同努力的方向。本論文共分為四章： 第一章,簡(jiǎn)要介紹了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能,綜述了研究蛋白質(zhì)標(biāo)記熒光探針的種類、標(biāo)記原理、定量分析蛋白質(zhì)的方法及應(yīng)用研究進(jìn)展。 第二章,采用熒光及吸收光譜研究了熒光素鈉(SF)與人血清白蛋白(HSA)的相互作用,根據(jù)Stern-Volmer、Scatchard及Van't Hoff等相關(guān)方程分別計(jì)算了猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及熱力學(xué)參數(shù),確定了HSA對(duì)SF的猝滅機(jī)理及作用方式,根據(jù)能量轉(zhuǎn)移理論求得SF與HSA的結(jié)合距離及能量轉(zhuǎn)移率,采用同步、三維熒光光譜研究了SF在結(jié)合過(guò)程中對(duì)HSA構(gòu)象的影響；實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),加入一定范圍濃度的HSA會(huì)顯著猝滅SF的熒光,且光強(qiáng)猝滅程度與HSA濃度成正比,據(jù)此建立測(cè)定血清蛋白的方法,線性范圍為0.15～15×10-7M,方法具有高靈敏度,檢測(cè)極限為1.46×10-8M；最后,考察體系pH值的變化和不同共存物質(zhì)對(duì)于蛋白質(zhì)定量分析結(jié)果的影響,利用SF作為熒光探針,在測(cè)定人血清中血清蛋白總量的實(shí)驗(yàn)中,其結(jié)果與G-250法基本一致。 第三章,采用溶劑化法、量子力學(xué)的二階攝動(dòng)理論計(jì)算新型1,8-萘酰亞胺類熒光探針?lè)肿恿孔赢a(chǎn)率、偶極矩等光物理參數(shù)；利用密度泛函理論Density Functional Theory(DFT)及Amsterdam Density Functional (ADF)計(jì)算軟件討論探針?lè)肿影l(fā)光機(jī)理；應(yīng)用光譜分析技術(shù)對(duì)探針?lè)肿优cHSA的相互作用進(jìn)行了詳細(xì)的研究：根據(jù)Stern-Volme、Scatchard及Van't Hoff方程計(jì)算并討論了結(jié)合參數(shù)、反應(yīng)熱力學(xué)參數(shù)及結(jié)合作用力類型；通過(guò)取代位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn),確定了探針?lè)肿釉贖SA中的結(jié)合位點(diǎn)；利用同步熒光光譜及圓二色譜考察了探針?lè)肿訉?duì)HSA次級(jí)結(jié)構(gòu)及構(gòu)象的影響；HSA的加入會(huì)猝滅探針?lè)肿訜晒?在一定范圍內(nèi)猝滅程度與HSA濃度成正比,據(jù)此,首次建立以1,8-萘酰亞胺類熒光探針測(cè)定蛋白的新方法,以新型1,8-萘酰亞胺衍生物作為熒光探針測(cè)定人血清中血清蛋白總量的結(jié)果與G-250法基本一致。 第四章,首次利用分子模擬技術(shù)和光譜法詳細(xì)研究了麥角甾4,6,8,22-四烯-3酮(麥角甾酮,國(guó)家一類新藥,ergone)及土大黃苷(RA)與HSA的相互作用,通過(guò)分子對(duì)接軟件確定ergone和RA與HSA相互作用的結(jié)合區(qū)域和結(jié)合模式。光譜研究結(jié)果表明,ergone和RA與HSA的結(jié)合作用猝滅了HSA的內(nèi)源性熒光并生成了疏水性的復(fù)合物；利用熒光猝滅相關(guān)公式和差熱量熱儀計(jì)算了結(jié)合反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)；三維、同步熒光光譜及CD數(shù)據(jù)揭示了ergone和RA對(duì)HSA次級(jí)結(jié)構(gòu)含量的影響。采用溶劑化法、量子力學(xué)的二階攝動(dòng)理論計(jì)算ergone和RA的光物理參數(shù),利用DFT理論及ADF軟了探討了兩種藥物的發(fā)光機(jī)理；基于血清蛋白對(duì)ergone和RA熒光光譜具有良好的響應(yīng)行為,在模擬生理?xiàng)l件下以ergone和RA為熒光探針,建立了一種靈敏的蛋白質(zhì)定量分析方法,HSA線性響應(yīng)濃度范圍為10-8～10-6M,檢測(cè)限(3δ)均達(dá)到10-9M,考察了金屬離子對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。以ergone和RA作為熒光探針測(cè)定人血清中血清蛋白總量的結(jié)果與G-250法基本一致。 本論文基于蛋白質(zhì)標(biāo)記熒光探針的研究及分析應(yīng)用趨勢(shì),綜合利用光譜分析技術(shù)及分子模擬計(jì)算軟件,建立了新的定量分析方法,研究的創(chuàng)新性如下： 1.以新型1,8-萘酰亞胺類衍生物、RA和ergone為熒光探針,采用量子力學(xué)的二階攝動(dòng)理論計(jì)算探針?lè)肿拥墓馕锢韰?shù),利用密度泛函理論(DFT)及ADF軟件研究了探針?lè)肿影l(fā)光機(jī)理； 2.綜合利用光譜分析技術(shù)(熒光光譜、吸收光譜、圓二色譜(CD))研究了SF、新型1,8-萘酰亞胺類衍生物、RA和ergone探針?lè)肿优cHSA的相互作用,根據(jù)Stern-Volmer、 Scatchard和Van't Hoff方程探討了探針?lè)肿优cHSA的結(jié)合機(jī)理、結(jié)合力類型以及結(jié)合位點(diǎn)等問(wèn)題； 3.通過(guò)計(jì)算機(jī)分子模擬技術(shù)考察了藥物分子與HSA的作用模式,構(gòu)建了結(jié)合模型,為利用藥物分子光譜特性進(jìn)行蛋白質(zhì)標(biāo)記提供了理論參考；采用三維、同步熒光光譜及圓二色譜考察了藥物分子在結(jié)合過(guò)程中對(duì)HSA構(gòu)象的影響,檢測(cè)、定量分析了藥物分子結(jié)合后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化； 4.通過(guò)熒光探針標(biāo)記蛋白質(zhì)后光物理參數(shù)變化實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)生理活動(dòng)的檢測(cè),建立蛋白質(zhì)定量分析新方法,該方法具有線性響應(yīng)范圍廣(10-8～10-6M)和靈敏度高(檢測(cè)限為10-10M)的特點(diǎn)。本法用于人血清樣品中血清蛋白總量的分析結(jié)果與G-250法和醫(yī)院提供數(shù)據(jù)基本一致。
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R346;O657.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2549564