【摘要】：背景 原林教授提出的筋膜學(xué)兩系統(tǒng)理論認為：人體由非特異性結(jié)締組織筋膜支架構(gòu)成的支持與儲備系統(tǒng)和被該筋膜支架所包繞的功能系統(tǒng)所構(gòu)成。支持與儲備系統(tǒng)以干細胞為核心,可為功能系統(tǒng)的更新提供細胞補充,并為功能系統(tǒng)的各種功能細胞的更新、代謝提供一個較為穩(wěn)定內(nèi)部環(huán)境和干細胞源。疏松結(jié)締組織是支持與儲備系統(tǒng)重要的組成部分,其中的脂肪源干細胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是機體重要的干細胞儲備之一。 目前對脂肪源干細胞的研究已取得重大進展。脂肪源干細胞是從脂肪組織中獲取的一類具有多向分化潛能的成體干細胞,稱之為adipose-derived stem cells (ADSCs)。Zuk等首次從人的脂肪組織懸液中分離出了可以在體外穩(wěn)定增殖、具有多向分化能力的脂肪組織提取細胞(processed lipoaspirate cells.PLA細胞)。與其他成體干細胞比較,PLA細胞具有來源廣泛、取材方便,創(chuàng)傷小且不存在免疫排斥反應(yīng)等優(yōu)點,實驗證明ADSCs具有跨胚層的多向分化潛能。它可以分化成中胚層來源的脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞、心肌細胞,外胚層來源的神經(jīng)細胞,也可以分化成內(nèi)胚層來源的內(nèi)皮細胞,及肝細胞等。但脂肪干細胞是否能夠向生殖細胞方向分化呢? 生殖細胞(germ cell)是多細胞生物體內(nèi)能繁殖后代的細胞的總稱,包括從原始生殖細胞直到最終已分化的生殖細胞。人類胚胎發(fā)育到第3周末,胚胎產(chǎn)生三個原始胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)。發(fā)育到第4周,胚外外胚層誘導(dǎo)臨近的上胚層內(nèi)產(chǎn)生原始生殖細胞(primordial germ cell, PGC)。遷移入生殖嵴后的PGC,開始了性別的分化。胚胎生殖細胞具有多能性,細胞標記與ES細胞幾乎是一致的,堿性磷酸酶染色和Oct4表達均呈陽性,通常用此標記檢測小鼠體內(nèi)組織中特化的PGC。 在胚胎6.25d, Vasa是生殖細胞特異的三磷酸腺(ATP)依賴的RNA解旋酶,Vasa編碼的RNA結(jié)合蛋白定位于胞質(zhì),在生殖嵴區(qū)域的PGC中表達,是遷移后期進入性腺的生殖細胞包括生殖母細胞特異性標記基因。、Vasa基因在卵巢和睪丸組織中表達,成體組織中檢測不到,是生殖細胞分化的高度特異性標志。到目前為止,Vasa是唯一對于生殖細胞系完全特異的,大多數(shù)種屬細胞中Vasa表達出現(xiàn)即代表生殖細胞特化。組織非特異堿性磷酸酶(tissue non-specificalkaline phosphatase, TNAP)作為PGC的標志物,可監(jiān)測PGC由尿囊到生殖嵴的遷移過程。在精子和卵細胞形成過程中,Stra8調(diào)節(jié)減數(shù)分裂起始,減數(shù)分裂是通過RA誘導(dǎo)的Stra8實現(xiàn)的。 干細胞體外誘導(dǎo)分化的方法大致有3種：①培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)分化因子,目前使用最多最廣泛；②與希望誘導(dǎo)分化的目的細胞共培養(yǎng)；③目的基因轉(zhuǎn)染,使擬誘導(dǎo)分化的細胞表達。本實驗是在培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)劑維甲酸和睪酮對脂肪干細胞進行誘導(dǎo)。維甲酸是配子形成的一個基本調(diào)節(jié)者。人們已經(jīng)很確定的是,維甲酸是由飲食維生素A合成的,是雌雄配子進入減數(shù)分裂所需要的,維生素A的缺乏會導(dǎo)致這個過程的停止。雌鼠的性腺性別被決定后減數(shù)分裂很快被發(fā)起,由于減數(shù)分裂是通過RA誘導(dǎo)的Stra8實現(xiàn)的,這種發(fā)起會被RA拮抗物或是敲去Stra8所阻斷。Stra8主要在減數(shù)分裂前生殖細胞中表達,一旦進入減數(shù)分裂,Stra8mRNA水平在生殖細胞中大大降低或消失。睪酮是由睪丸分泌的一種類固醇激素,是人體內(nèi)主要的雄激素,與男性第二性征的發(fā)育有關(guān),在精子發(fā)生過程中具有重要作用。 本實驗基于筋膜學(xué)理論,研究探索脂肪源干細胞是否在體外誘導(dǎo)情況下具有向生殖系分化潛能,即在體外誘導(dǎo)情況下,觀察是否能檢測出生殖系特異性基因的表達。 目的 MSCs的多組織來源性,與筋膜結(jié)締組織支架的全身分布性具有一致性,其橫向、縱向分化的生物學(xué)特性,與筋膜結(jié)締組織對機體的支持儲備作用也是一致的。ADSCs是筋膜中未分化干細胞的一種儲備形式。本實驗采用大鼠筋膜結(jié)締組織皮下脂肪作為組織來源,分離培養(yǎng)ADSCs,并對其表型鑒定,探討筋膜結(jié)締組織中對機體產(chǎn)生支持儲備作用的細胞學(xué)基礎(chǔ)；研究ADSCs在維甲酸誘導(dǎo)下是否能表達生殖細胞相關(guān)基因Stra8, Vasa, Oct4, Dazl, Nobox和Piwil,進而判斷ADSCs是否具有向生殖細胞分化的潛能；研究在睪酮和維甲酸單獨和聯(lián)合誘導(dǎo)下,ADSCs細胞周期的變化,進而判斷睪酮和維甲酸對細胞周期的影響。 1通過細胞分離培養(yǎng)判斷非特異性筋膜結(jié)締組織中是否存在未分化的間充質(zhì)干細胞,以及這種干細胞的相關(guān)特性； 2、通過RT-PCR技術(shù)觀察ADSCs在維甲酸誘導(dǎo)下是否能表達生殖細胞相關(guān)基因Stra8和Vasa,進而判斷ADSCs是否具有向生殖細胞分化的潛能； 3、通過定量PCR技術(shù)觀察ADSCs在維甲酸誘導(dǎo)下是否能表達生殖細胞相關(guān)基因Oct4, Dazl, Nobox, Piwil及表達量,進而判斷ADSCs是否具有向生殖細胞分化的潛能； 4、探索在睪酮和維甲酸單獨和聯(lián)合誘導(dǎo)下,ADSCs細胞周期的變化,進而判斷睪酮和維甲酸對細胞周期的影響。 方法 1、取2月齡SD雌性大鼠腹股溝部皮下脂肪組織,采用酶消化法分離、培養(yǎng)脂肪源干細胞。通過細胞形態(tài)學(xué)、功能學(xué)、流式細胞術(shù)鑒定非特異性筋膜結(jié)締組織中的脂肪源干細胞是否符合間充質(zhì)干細胞的特性以及部分表面標記,以驗證非特異性筋膜結(jié)締組織中是否含有間充質(zhì)干細胞。 2、將第四代ADSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)和成脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后,分別進行相應(yīng)的茜素紅和油紅O染色,以鑒定ADSCs的分化潛能。同時取培養(yǎng)的第四代ADSCs進行流式細胞術(shù)檢測部分表面抗原,證明ADSCs干細胞特性。 3、取培養(yǎng)的第四代ADSCs的總RNA進行RT-PCR,用微量酶標儀檢測原始生殖細胞標記非特異性堿性磷酸酶；分別檢測維甲酸誘導(dǎo)前后細胞中Stra8和Sasa的表達,以睪丸細胞中的Stra8和Vasa的表達作陽性對照。 4、取培養(yǎng)的第四代ADSCs分①對照組(不加任何誘導(dǎo)劑),②10-5mol/LRA誘導(dǎo)2周,③10-5mol/LRA誘導(dǎo)4周,④10-6mol/LRA誘導(dǎo)2周,⑤10-6mol/LRA誘導(dǎo)3周,⑥10-6mol/LRA誘導(dǎo)4周,然后分別檢測各組中生殖細胞相關(guān)基因Oct4, Dazl, Nobox, Piwil的表達。 5、取培養(yǎng)的第四代ADSCs分①對照組(不加任何誘導(dǎo)劑),②10-5mol/LRA組,③10-6mol/LRA組,④10-5mol/LRA+睪酮組,⑤10-6mol/LRA+睪酮組,⑥睪酮組,各組培養(yǎng)36小時后行流式細胞儀檢測各細胞分期的變化。 結(jié)果 1、光學(xué)顯微鏡下觀察貼壁ADSCs形態(tài)多呈梭形、多邊形,細胞大小均勻； 2、流式細胞術(shù)鑒定ADSCs的表面抗原顯示CD29、CD90、CD106呈陽性,CDllb、CD45、CD49d呈陰性； 3、ADSCs在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)14天后,油紅O染色顯示特異性脂滴,而陰性對照孔中未觀察到紅染的脂滴。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)21天后,茜素紅染色顯示礦化結(jié)節(jié)呈特異性的粉紅色,陰性對照孔中未見被染成粉紅色的鈣結(jié)節(jié)； 4、微量酶標儀檢測顯示ADSCs經(jīng)維甲酸誘導(dǎo)后堿性磷酸酶的表達顯著增高,將ADSCs分別用10-Smol/L,10-6mol/L,10-7mol/L RA誘導(dǎo)7d的OD值分別為0.585±0.04,0.268±0.07,0.151-0.03,對照組為0.068±0.01,誘導(dǎo)14d的OD值分別為0.417±0.02,0.341±0.01,0.187±0.02,對照組為0.067±0.01,說明RA能顯著性促進ADSCs堿性磷酸酶的表達(P0.01)。RT-PCR結(jié)果顯示ADSCs中RA誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后均不表達stra8和vasa,日性對照組睪丸細胞中可表達生殖細胞標記基因stra8和vasa。 5、定量PCR結(jié)果顯示,ADSCs經(jīng)維甲酸誘導(dǎo)后能夠表達oct4, dazl, nobox, piwil四個基因,oct4, dazl, nobox的表達規(guī)律較為一致,均在10-6mol/L RA誘導(dǎo)3周時表達量最高,piwil在10-6mol/L RA誘導(dǎo)4周時表達量最高。 6、流式細胞術(shù)顯示,各組G1期的細胞比例分別為80.3%,82.0%,85.2%,81.0%,65.1%,68.5%,各組S期的細胞比例分別為14.7%,12.7%,9.2%,13.5%,28.6%,22.7%。 結(jié)論 1、通過本實驗筆者認為在發(fā)育成熟大鼠的筋膜結(jié)締組織的脂肪中存在多能干細胞,而且可通過消化-貼壁-傳代的程序分離得到這些ADSCs;為筋膜結(jié)締組織對機體發(fā)揮著支持與儲備作用(干細胞儲備)提供實驗支持,即筋膜結(jié)締組織中的ADSCs為機體損傷修復(fù)提供細胞來源。 2、ADSCs具有成體間充質(zhì)干細胞特性,具有多向分化潛能,經(jīng)定向誘導(dǎo)培養(yǎng)后可向成骨和成脂分化。 3、ADSCs在維甲酸誘導(dǎo)下能夠表達原始生殖細胞標記堿性磷酸酶,但用10-5mol/L維甲酸誘導(dǎo)7d不能表達生殖標記基因Stra8和Vasa,睪丸細胞中表達生殖標記基因Stra8和Vasa。 4、在維甲酸誘導(dǎo)下ADSCs能夠表達生殖細胞相關(guān)基因Oct4, Dazl, Nobox, Piwil,表明ADSCs生維甲酸誘導(dǎo)下具有向生殖細胞方向分化的潛在能力。 5、維甲酸能夠抑制脂肪源干細胞的增殖,睪酮則能夠促進脂肪源干細胞的增殖。 綜上所述,本研究分別采用了細胞分離培養(yǎng)、流式細胞術(shù),成脂成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)及檢測等技術(shù)手段,從ADSCs形態(tài)特征,成脂、成骨誘導(dǎo)、表面標志等方面探討ADSCs。證實在成熟大鼠的結(jié)締組織中存在間充質(zhì)干細胞,提示分布于全身的筋膜結(jié)締組織支架很可能就是機體內(nèi)在的“干細胞庫”。這種干細胞易于分離培養(yǎng),具有良好的增殖、分化能力。筆者認為ADSCs是筋膜中間充質(zhì)干細胞的一種儲備形式,更重要的是筋膜結(jié)締組織對機體的支持與儲備起著細胞儲備作用,為機體損傷修復(fù)提供干細胞支持。 通過微量酶標儀檢測,ADSCs在維甲酸誘導(dǎo)下原始生殖細胞標記堿性磷酸酶的表達顯著升高,通過RT-qPCT技術(shù)檢測證實ADSCs用10-5mol/L維甲酸誘導(dǎo)7d不能表達生殖標記基因Stra8和Vasa,在維甲酸誘導(dǎo)下ADSCs能夠表達生殖細胞相關(guān)基因Oct4, Dazl, Nobox, Piwil,表明ADSCs具有向生殖細胞方向分化的潛能。維甲酸能夠抑制ADSCs增殖。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R329

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 原林,姚大衛(wèi),唐雷,黃文華,焦培峰,陸云濤,戴景興,張輝,賀振泉,鐘世鎮(zhèn);針灸經(jīng)穴的數(shù)字解剖學(xué)研究[J];解剖學(xué)報;2004年04期

2 原林;王軍;王春雷;沈?qū)毩?戴景興;黃泳;;人體內(nèi)新的功能系統(tǒng)——支持儲備及自體監(jiān)控系統(tǒng)新學(xué)說[J];科技導(dǎo)報;2006年06期

3 楊立業(yè),劉相名,孫兵,惠國楨,費儉,郭禮和;Adipose tissue-derived stromal cells express neuronal phenotypes[J];Chinese Medical Journal;2004年03期

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本文編號：2548206