【摘要】：目的：探討γ-分泌酶抑制劑DAPT抑制Notch信號前后，在肺成纖維細胞中Notch信號通路受體Notch1、配體Jagged1及肌成纖維細胞標志因子α-SMA表達的變化,研究Notch信號通路在肺成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化中的作用。 方法：采用胰酶消化法，從新出生2-3天的S-D大鼠肺組織中分離培養(yǎng)肺成纖維細胞，波形蛋白（Vimentin）免疫細胞化學法鑒定培養(yǎng)至第三代的成纖維細胞的純度，無血清培養(yǎng)基同步24h，再將細胞分為對照組、TGF-β1組、TGF-β1+DAPT組；TGF-β1組及TGF-β1+DAPT組加入5ng/ml的TGF-β1誘導成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，TGF-β1+DAPT組同時加入500nmol/l的DAPT抑制Notch信號的表達；分別采用免疫細胞化學法檢測α-SMA蛋白的表達變化，RT-PCR法檢測Notch1、Jagged1和α-SMA mRNA的表達變化，Western-blot法檢測Notch1、Jagged1和α-SMA蛋白的表達變化；采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。 結果：（1）Vimentin免疫細胞化學：幾乎100%細胞胞漿內可見棕褐色顆粒及條紋，證明胰酶消化法培養(yǎng)至第三代的幾乎全為成纖維細胞；（2）α-SMA免疫細胞化學：未加藥物干預的對照組細胞中少部分細胞內有淡黃色顆粒及條紋，TGF-β1組大部分細胞內有黃色和黃褐色顆粒及條紋，TGF-β1+DAPT組部分細胞內有淡黃色顆粒及條紋；（3）α-SMAmRNA和蛋白表達：TGF-β1組α-SMA的mRNA和蛋白的相對吸光度值（0.8510.027和0.7850.020）較對照組（0.3950.018和0.3910.022）和TGF-β1+DAPT組（0.3540.029和0.3970.016）顯著升高，但對照組與TGF-β1+DAPT組比較則差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）；（4）Notch1mRNA和蛋白表達：TGF-β1組Notch1mRNA和蛋白相對吸光度值分別為0.783±0.018和0.701±0.026，較對照組（0.278±0.022和0.312±0.019）和TGF-β1+DAPT組（0.313±0.029和0.345±0.022）明顯升高，而對照組和TGF-β1+DAPT組相比較則差異無統(tǒng)計學意義（P0.05）；（5）Jagged1mRNA和蛋白表達：TGF-β1組Jagged1mRNA和蛋白相對吸光度值（0.851±0.028和0.847±0.026）較對照組（0.392±0.021和0.394±0.027）和TGF-β1+DAPT組（0.404±0.024和0.409±0.026）升高顯著，對照組和TGF-β1+DAPT組相比較則差異無統(tǒng)計學意義（P0.05） 結論：TGF-β1可以誘導肺成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，轉化過程中Notch1、Jagged1和α-SMA mRNA及蛋白均表達升高，DAPT抑制Notch信號后，可以阻止肺成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化，，下調Notch1、Jagged1和α-SMAmRNA及蛋白的表達，進而抑制肺纖維化。
【圖文】：

第 3 章 結果3.1 Vimentin 免疫細胞化學培養(yǎng)至第三代的大鼠肺成纖維細胞，可見均為長梭形細胞，細胞大小均一。Vimentin 染色后幾乎所有細胞漿內均可見棕褐色顆粒及條紋，即全為 Vimentin陽性細胞，證明胰酶消化法培養(yǎng)的細胞傳至第三代時全為成纖維細胞（。見圖 3.1）

注：1：對照組；2：TGF-β1組；3：TGF-β1+DAPT組圖 3.2 α- SMA 免疫細胞化學電鏡結果3.3 α-SMA mRNA 及蛋白表達在 RT-PCR 產物凝膠電泳圖中可見，α-SMA 與 β-actin 分別在 365bp 和 207bp處有相應的表達條帶。與對照組（0.354±0.029）和 TGF-β1+DAPT 組（0.395±0.018）相比，TGF-β1 組（0.851±0.027）α-SMA mRNA 表達量明顯升高，對照組和 DAPT組之間無明顯差異（圖 3.3，表 3.1）。α-SMA 蛋白 SDS-PAGE 電泳提示在 43KD附近可見一清晰亮帶，對照組、TGF-β1 組與 TGF-β1+DAPT 組蛋白吸光光度值分別為 0.375±0.017、0.785±0.020 和 0.397±0.016，三組之間的表達規(guī)律與 α-SMAmRNA 相似（圖 3.4，表 3.1）。
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R363

【參考文獻】

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1 王穎;于潔;張芳婷;;Notch信號通路與細胞的增殖分化[J];廣東醫(yī)學;2009年07期

本文編號：2543296