【摘要】：背景：研究證實(shí)超極化激活環(huán)化核苷酸門(mén)控通道HCN (hyperpolarization-activated, cyclic nucleotide-gated)電流在調(diào)控心臟的自發(fā)搏動(dòng)中起著非常重要的作用。 目的：觀察HCN2基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的293t細(xì)胞中目的基因在核酸和蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。 方法：1、以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000將含全長(zhǎng)hHCN2基因的質(zhì)粒CMV-hHCN2-3xHA-IRES-EGFP轉(zhuǎn)染至293t細(xì)胞中。2、通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR分別定性定量地檢測(cè)hHCN2在核酸水平上的表達(dá)。3、通過(guò)Western-blot定性地檢測(cè)hHCN2在蛋白水平的表達(dá)。 結(jié)果：1、用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000成功地將質(zhì)粒CMV-hHCN2-3xHA-IRES-EGFP轉(zhuǎn)染至293t細(xì)胞中。2、逆轉(zhuǎn)錄PCR定性地檢測(cè)到在100bp-250bp處可見(jiàn)高度特異DNA的條帶,與攜帶HCN2基因的質(zhì)粒擴(kuò)增出的片段位置相同。實(shí)時(shí)熒光定量PCR定量地檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間比較統(tǒng)計(jì)學(xué)差異非常顯著(P=0.006),且實(shí)驗(yàn)組的hHCN2 mRNA的表達(dá)量較對(duì)照組高,實(shí)驗(yàn)組hHCN2 mRNA的表達(dá)量是對(duì)照組的2倍多,但不到4倍。3、Western-blot定性地檢測(cè)hHCN2蛋白水平的表達(dá),與HCN2蛋白的分布相符合。且轉(zhuǎn)染組的表達(dá)水平明顯高于未作處理組及對(duì)照組。 結(jié)論：質(zhì)粒CMV-hHCN2-3xHA-IRES-EGFP成功轉(zhuǎn)染后的293t細(xì)胞中hHCN2基因可以在核酸和蛋白水平表達(dá)。
【圖文】：

六、RT一PCR定量檢測(cè)hHCNZmRNA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:循環(huán)曲線圖所示(圖8):取實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組中各引物擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的量相同時(shí)的循環(huán)數(shù)Ct數(shù)據(jù)分析:實(shí)驗(yàn)組循環(huán)數(shù)X士S口為22.59土0.37，對(duì)照組循環(huán)數(shù)X士SD為23.99士0.28;實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參循環(huán)數(shù)x士sD為2327士0.19，對(duì)照組內(nèi)參循環(huán)數(shù)x士人口為23.093士0.12;兩兩樣木均數(shù)之間作比較用t檢驗(yàn)，所有統(tǒng)計(jì)計(jì)算由SPSSIO.0軟件完成。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間比較尸=0.006<0.01，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異非常顯著，說(shuō)明在獲得相同量的反應(yīng)產(chǎn)物時(shí)實(shí)驗(yàn)組循環(huán)數(shù)較對(duì)照組少，從而說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組的hHCNZmRNA的表達(dá)量較對(duì)照組高，Ct值均數(shù)相差大于1且小于2，，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組的hHCNZmRNA的表達(dá)量是對(duì)照組的2倍多，但不到4倍;而實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參與對(duì)照組內(nèi)參之間比較P=O.241>0.05無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明在獲得相同量的反應(yīng)產(chǎn)物時(shí)實(shí)驗(yàn)組循環(huán)數(shù)與對(duì)照組之間無(wú)明顯差異，從而說(shuō)明實(shí)驗(yàn)組內(nèi)
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R541.7;R329

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2540338