【摘要】：神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫三大系統(tǒng)相互聯(lián)系,相互制約,構(gòu)成復(fù)雜的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)(NEI),在整體水平調(diào)節(jié)、維持機(jī)體的正常生理機(jī)能。內(nèi)源性神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)肽α-黑素細(xì)胞刺激素(a-MSH)能夠通過結(jié)合黑皮質(zhì)素受體(MCRs)作用于免疫系統(tǒng)的不同細(xì)胞,或下調(diào)致炎因子的產(chǎn)生或抑制致炎因子的作用,產(chǎn)生抗炎和免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)；也可以通過結(jié)合中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的MCRs下行調(diào)控炎癥反應(yīng)。a-MSH在多種實(shí)驗性炎癥動物模型中已顯示有明顯的抗炎效應(yīng),但其作用機(jī)制尚未闡明。 在細(xì)菌脂多糖(LPS)的致炎生物學(xué)效應(yīng)中,IKK/IKB/NF-κB-(NF-κB)通路和Raf-1/MEK1-MEK2/ERK1-ERK2 (ERK)通路是其誘導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的重要信號通路。在NF-κB通路中,IKK扮演了非常重要的角色,盡管上游信號路徑不同,但是最終都匯集到IKK。其中,IKKβ亞基在催化IкB蛋白磷酸化以及調(diào)節(jié)經(jīng)典、非經(jīng)典NF-κB活化通路中發(fā)揮重要作用,IKKβ被認(rèn)為是IKK復(fù)合酶體的一個重要亞基。在ERK通路中,激活的Raf-1能夠繼續(xù)活化其下游的絲裂素活化蛋白激酶激酶(MEK)、絲裂素活化蛋白激酶(MAPK),進(jìn)一步激活下游轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,促進(jìn)TNF-α的產(chǎn)生。ERK通路還能偶聯(lián)NF-κB信號通路：當(dāng)ERK通路下游的S6激酶(p90)被激活后,能夠使IκBα的Tyr殘基磷酸化降解,NF-κB被釋放入核,促進(jìn)TNF-α的產(chǎn)生。 微小RNA (microRNA)是一類18-23個核苷酸組成的非編碼蛋白質(zhì)的單鏈小RNA分子,能夠通過結(jié)合靶基因的mRNA而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的功能。研究表明,microRNA影響著幾乎所有的信號通路,參與多種生理病理過程,包括發(fā)育、分化、凋亡、脂肪代謝、病毒感染和癌癥等。深入地研究microRNA的發(fā)生、作用機(jī)理和功能,將會揭示這些生物過程乃至一些疑難疾病的分子基礎(chǔ)。盡管已有研究表明α-MSH能夠通過調(diào)節(jié)PKA、P38激酶、IкBα等直接或間接地調(diào)控上述兩條信號通路,從而抑制TNF-α等致炎因子的表達(dá),發(fā)揮抗炎作用,但α-MSH是否通過影響microRNA的水平進(jìn)而調(diào)控這兩條信號通路的研究未見報道。因此,我們通過如下實(shí)驗著重探討了在LPS刺激下和加α-MSH處理后相關(guān)nicroRNA的變化及其調(diào)節(jié)IKKβ和Raf-1表達(dá)進(jìn)而調(diào)控這兩條信號通路的機(jī)制。 第一部分α-MSH抑制THP-1細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的產(chǎn)生并上調(diào)hsa-miR-15b和hsa-miR-199a的表達(dá) 在第一部分實(shí)驗中,我們采用人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞,分別加入5×10-8mol/Lα-MSH、50 ng/ml LPS、5×10-8mol/Lα-MSH+50 ng/ml LPS刺激(即α-MSH組、LPS組和α-MSH+LPS組),另設(shè)未進(jìn)行處理的對照組(control組),用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定TNF-α的分泌水平,用Real-Time qPCR檢測TNF-αmRNA的相對表達(dá)量。ELISA結(jié)果顯示：α-MSH+LPS組產(chǎn)生TNF-α的水平顯著低于LPS組(P0.01), Real-Time qPCR的結(jié)果也表明：α-MSH+LPS組TNF-α的mRNA表達(dá)量顯著低于LPS組(P0.01),說明α-MSH能夠抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生。 我們進(jìn)一步通過targetscans、MiRBase等microRNAs靶標(biāo)預(yù)測方法預(yù)測到hsa-miR-15b和hsa-miR-199a能夠分別作用于Raf-1、IKKβ的3‘UTR區(qū)。為探明在THP-1中是否存在hsa-miR-15b和hsa-miR-199a以及α-MSH、LPS對這兩種microRNAs的影響,同上所述設(shè)立control組、α-MSH組、LPS組和α-MSH+LPS組,采用Real-Time qPCR分別檢測四組細(xì)胞中hsa-miR-15b和hsa-miR-199a的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示：THP-1細(xì)胞中存在hsa-miR-15b和hsa-miR-199a;α-MSH能夠上調(diào)二者的表達(dá)(與control組比較,P0.01),LPS則抑制二者的表達(dá)(與control組比較,P0.01)；同時, hsa-miR-15b和hsa-miR-199a在α-MSH+LPS組的相對表達(dá)量都顯著高于LPS組(P0.01),說明α-MSH能夠促進(jìn)hsa-miR-15b和hsa-miR-199a的表達(dá),拮抗LPS對二者表達(dá)的抑制作用。 第二部分α-MSH抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α并上調(diào)hsa-mir-15b和hsa-mir-199a的表達(dá) 上述結(jié)果表明在非正常人單核細(xì)胞(THP-1)來源的巨噬細(xì)胞中存在hsa-miR-15b和hsa-miR-199a,并且α-MSH和LPS均能影響二者的表達(dá)。在第二部分實(shí)驗中,我們進(jìn)一步研究了正常人外周血來源的單核巨噬細(xì)胞中是否也存在hsa-miR-15b和hsa-miR-199a,以及α-MSH、LPS對二者表達(dá)的影響。首先用不同濃度LPS(0、1、10、100、1000 ng/ml)作用于人單核巨噬細(xì)胞6 h,以確定LPS誘導(dǎo)TNF-a產(chǎn)生的量效關(guān)系；然后設(shè)立不同時間點(diǎn)(0、30 min、45 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h)檢測LPS (20ng/ml)刺激細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α的量,以明確時效關(guān)系。接著研究了不同濃度α-MSH (10-13、10-12、10-11、10-10、10-9、10-8mol/L)對LPS (20ng/ml)誘導(dǎo)TNF-α產(chǎn)生的影響,以確定α-MSH的最佳濃度。ELISA結(jié)果顯示：在不同濃度LPS刺激下,單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α隨LPS濃度的增加而增加,其中以1000 ng/ml LPS刺激作用最強(qiáng),說明人單核巨噬細(xì)胞TNF-α的合成對LPS的刺激呈劑量依賴性；在LPS(20ng/ml)刺激45 min后開始產(chǎn)生TNF-α,在2 h-6 h內(nèi)顯著上升,8 h后TNF-α產(chǎn)生相對平緩,但仍能保持較高濃度；a-MSH (10-12mol/L)即可抑制LPS(20ng/ml)作用于人單核巨噬細(xì)胞2 h誘導(dǎo)的TNF-a的產(chǎn)生,其中a-MSH (10-8mol/L)的抑制效果最強(qiáng)。 用Real-Time qPCR檢測正常人外周血來源的單核巨噬細(xì)胞中hsa-miR-15b和hsa-miR-199a的表達(dá),觀察a-MSH、LPS作用下隨時間(15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h)不同二者的變化規(guī)律。結(jié)果顯示：單核巨噬細(xì)胞中亦存在hsa-miR-15b和hsa-miR-199a; a-MSH組的hsa-miR-15b在15 min-8 h之間一直呈上升趨勢,hsa-miR-199a在4 h時達(dá)到高峰后逐漸下降；LPS組的hsa-miR-15b和hsa-miR-199a則一直呈下降趨勢；a-MSH+LPS組的hsa-miR-199a在加入LPS刺激4 h前一直呈上升趨勢,在4 h后逐漸下降；hsa-miR-15b和hsa-miR-199a在a-MSH+LPS組中的變化趨勢與其在a-MSH組中的變化趨勢一致,但相對表達(dá)量低于a-MSH組。 為探明a-MSH、LPS以及a-MSH+LPS刺激下hsa-miR-15b和hsa-miR-199a的預(yù)測靶標(biāo)Raf-1和IKKP的表達(dá)是否發(fā)生相應(yīng)變化,我們采用Real-Time qPCR和Western blotting檢測了細(xì)胞受不同刺激后Raf-1和IKKβ的mRNA和蛋白表達(dá)水平。Real-Time qPCR結(jié)果顯示：a-MSH能夠抑制Raf-1mRNA的表達(dá)(與control組比較,P0.01),但對IKKβmRNA的表達(dá)無明顯影響；LPS則上調(diào)Raf-1和IKKP mRNA的表達(dá)(與control組比較,P0.01),同時,a-MSH+LPS組Raf-1 mRNA顯著低于LPS組(P0.05),說明a-MSH能夠拮抗LPS對Raf-1 mRNA的上調(diào),抑制其表達(dá)。Western blotting結(jié)果顯示:a-MSH能夠抑制Raf-1蛋白表達(dá),但對IKKβ蛋白表達(dá)無影響；LPS則能夠上調(diào)Raf-1和IKKβ蛋白的表達(dá)。 上述結(jié)果表明：在正常人外周血來源的單核巨噬細(xì)胞中存在hsa-miR-199a和hsa-miR-15b; a-MSH和LPS在不同時間均能影響二者的表達(dá)；另外,a-MSH僅能下調(diào)Raf-1mRNA和蛋白的表達(dá),對IKKβ無顯著影響,LPS則能上調(diào)Raf-1、IKKβmRNA和蛋白的表達(dá)。 第三部分Hsa-miR-15b和hsa-miR-199a靶標(biāo)的驗證和對LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-a的影響 為進(jìn)一步驗證IKKβ、Raf-1是否分別為hsa-miR-199a和hsa-miR-15b的靶基因,我們先將hsa-miR-15b、hsa-miR-199a的mimics、mimics control、inhibitor、inhibitor control分別轉(zhuǎn)染正常人外周血單核巨噬細(xì)胞,即為mimics組、mimics control組、inhibitor組、inhibitor control組。通過Western blotting檢測Raf-1IKKβ的蛋白表達(dá)變化,通過Real-Time qPCR檢測Raf-1、IKKβ的mRNA表達(dá)量。然后,將Raf-1和IKKβ的3'UTR區(qū)分別構(gòu)建到熒光報告基因質(zhì)粒載體,將hsa-miR-15b和Raf-13’UTR熒光報告基因質(zhì)粒以及hsa-miR-199a和IKKβ的3’UTR熒光報告基因質(zhì)粒分別共轉(zhuǎn)入293T細(xì)胞,通過雙熒光報告素酶檢測系統(tǒng)檢測hsa-miR-15b和hsa-miR-199a是否分別作用于Raf-1 3’UTR區(qū)和IKKβ的3’UTR區(qū)。 Western blotting結(jié)果顯示：hsa-miR-15b和hsa-miR-199a的mimics能夠分別抑制Raf-1和IKKβ的蛋白表達(dá)(與mimics control組比較), hsa-miR-15b和hsa-miR-199a的inhibitor則分別促進(jìn)Raf-1和IKKβ的蛋白表達(dá)(與inhibitor control組比較)；Real-Time qPCR結(jié)果顯示：hsa-miR-15b的mimics能夠抑制Raf-1的mRNA表達(dá)(hsa-miR-15b mimics與mimics control組比較,P0.01)；hsa-miR-15b inhibitor則促進(jìn)Raf-1 mRNA表達(dá)(hsa-miR-15b inhibitor與inhibitor control組比較,P0.01),但hsa-miR-199a mimics和inhibitor對IKKβmRNA的影響并不明顯,說明hsa-miR-199a僅抑制IKKβ的翻譯,而不影響IKKβ的轉(zhuǎn)錄。雙熒光報告素酶檢測系統(tǒng)檢測結(jié)果表明：hsa-miR-15b和hsa-miR-199a能夠分別作用于Raf-1 3'UTR區(qū)和IKKβ的3’UTR區(qū)。上述結(jié)果表明：Raf-1和IKKβ分別是hsa-miR-15b和hsa-miR-199a的靶標(biāo),并且,hsa-miR-15b能通過降低Raf-1的mRNA水平而抑制Raf-1的表達(dá)；hsa-miR-199a僅在翻譯水平上抑制IKKβ。 為進(jìn)一步研究hsa-miR-15、hsa-miR-199a對LPS誘導(dǎo)的TNF-α的影響,我們將hsa-miR-15b、hsa-miR-199a的mimics、inhibitor分別轉(zhuǎn)染人外周血單核巨噬細(xì)胞,實(shí)驗分組：mimics control組、hsa-miR-15b mimics組、hsa-miR-199a mimics組、hsa-miR-15b+hsa-miR-199a mimics組以及inhibitor control組、hsa-miR-15b inhibitor組、hsa-miR-199a inhibitor組、hsa-miR-15b+hsa-miR-199a inhibitor組。然后加入LPS刺激4 h,ELISA檢測上清TNF-α, Real-Time qPCR檢測TNF-αmRNA。 ELISA結(jié)果顯示：hsa-miR-15b mimics組、hsa-miR-199a mimics組、hsa-miR-15b+hsa-miR-199a mimics組的TNF-α分泌量均顯著低于mimics control組(與mimics control比較,hsa-miR-15b mimics組P0.05,hsa-miR-199a mimics組P0.05, hsa-miR-15b+hsa-miR-199a mimics組P0.01)；hsa-miR-15b inhibitor組、hsa-miR-199a inhibitor組、hsa-miR-15b+hsa-miR-199a inhibitor組的TNF-α分泌量均顯著高于inhibitor control組(與inhibitor control組比較,各組P0.05)；Real-Time qPCR結(jié)果也表明:hsa-miR-15b mimics組、hsa-miR-199a mimics、hsa-miR-15b+hsa-miR-199a組的TNF-αmRNA的表達(dá)量均顯著低于mimics control組(與mimics control組比較,各組P0.01),hsa-miR-15b inhibitor組、hsa-miR-199a inhibitor組、hsa-miR-15b+hsa-miR-199a inhibitor組的TNF-αmRNA的表達(dá)量均顯著高于inhibitor control組(與inhibitor control組比較,各組P0.01),說明hsa-miR-15b、hsa-miR-199a能夠抑制TNF-αmRNA和蛋白的表達(dá)。 綜上所述,通過本課題的研究發(fā)現(xiàn),在THP-1細(xì)胞和正常人外周血來源的單核巨噬細(xì)胞中均存在hsa-miR-15b和hsa-miR-199a;α-MSH能夠上調(diào)hsa-miR-15b和hsa-miR-199a的表達(dá),LPS則抑制二者的表達(dá)；α-MSH通過上調(diào)hsa-miR-15b抑制ERK通路中的關(guān)鍵組分Raf-1的表達(dá),抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α產(chǎn)生；LPS則通過下調(diào)hsa-miR-15b和hsa-miR-199a,促進(jìn)IKKP、Raf-1的表達(dá),從而促進(jìn)TNF-α的產(chǎn)生。本研究從microRNA調(diào)控層面初步揭示了α-MSH的抗炎作用機(jī)制,為探明神經(jīng)內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)在疾病發(fā)生與防治中的作用供了新的思路,并為抗炎藥物的篩選和研發(fā)提供了新靶標(biāo)。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R363

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2540280