【摘要】：RNA干擾(RNA interference, RNAi)是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA誘導(dǎo)的特異轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。其作用機(jī)制是雙鏈RNA被Dicer降解,產(chǎn)生小片段干擾RNA(small-interfering RNA, siRNA),這些siRNA與序列同源的靶RNA互補(bǔ)結(jié)合,由特異性酶降解靶RNA,從而抑制靶基因表達(dá)。這種真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)、調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制目前已發(fā)展出RNAi技術(shù),并成功用于基因功能和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)上下游分子相互關(guān)系的研究。同時(shí)作為功能基因組研究領(lǐng)域中的有力工具,利用siRNA文庫進(jìn)行高通量篩選也越來越為人們所重視。 我的主要工作包含兩部分的內(nèi)容,一是驗(yàn)證Nr2f2是否具有促細(xì)胞增殖的作用。我們利用隨機(jī)siRNA文庫進(jìn)行了基于功能表型的篩選,篩選出一個(gè)可促進(jìn)小鼠MC3T3-E1前成骨細(xì)胞增殖的siRNA:siRNA-A281,小鼠全基因組表達(dá)譜芯片分析結(jié)果表明,MC3T3-E1細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-A281后,細(xì)胞增殖速度加快,同時(shí)Nr2f2的表達(dá)增高,提示Nr2f2很可能介導(dǎo)了siRNA-A281的促M(fèi)C3T3-E1細(xì)胞增殖的作用。 Nr2f2(核受體亞家族2,F組,第2號(hào)成員)也叫做COUP-TFⅡ(雞卵清蛋白上游啟動(dòng)子-轉(zhuǎn)錄因子2),編碼類固醇/甲狀腺激素受體超家族的一個(gè)孤兒核受體。Nr2f2蛋白是一個(gè)配體誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子,參與調(diào)節(jié)許多不同基因的表達(dá),在控制包括心臟、血管、肌肉和四肢等一系列組織和器官發(fā)育的過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。但目前對(duì)于Nr2f2在細(xì)胞增殖方面的功能卻知之甚少,至今尚無Nr2f2影響前成骨細(xì)胞增殖的報(bào)道。 為明確Nr2f2在前成骨細(xì)胞增殖中的作用,本文在前期工作線索的基礎(chǔ)上對(duì)Nr2f2在前成骨細(xì)胞增殖中的作用進(jìn)行了初步的研究。構(gòu)建了pcDNA-Nr2f2表達(dá)質(zhì)粒,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后檢測(cè)了細(xì)胞增殖速度及細(xì)胞周期分布。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Nr2f2過表達(dá)能夠促進(jìn)小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增殖速度,主要通過使S期細(xì)胞比例增加而發(fā)揮作用。 我的第二部分工作是對(duì)Nov基因在促進(jìn)細(xì)胞增殖方面的功能進(jìn)行初步的探討。腎母細(xì)胞瘤過度表達(dá)基因(nephroblastoma overexpressed gene, Nov)是CCN家族的成員之一,也叫做CCN3,其編碼一種分泌的信號(hào)蛋白,目前研究表明其在細(xì)胞增殖與分化方面起到調(diào)控作用。MTS結(jié)果表明,過表達(dá)Nov基因后MC3T3-E1細(xì)胞增殖速度加快。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)人骨肉瘤細(xì)胞MG63中Nov mRNA有一個(gè)點(diǎn)突變。我們希望這些結(jié)果能夠?yàn)閷?duì)這兩個(gè)基因作用機(jī)制的研究提供新的線索。 綜上所述,我們利用基于細(xì)胞功能表型的高通量siRNA文庫篩選方法發(fā)現(xiàn)Nr2f2在增殖加快的MC3T3-E1細(xì)胞中的表達(dá)增高,Nr2f2過表達(dá)能夠促進(jìn)小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1的增殖速度,主要通過使S期細(xì)胞比例增加而發(fā)揮作用。同時(shí)初步探討了Nov基因促細(xì)胞增殖的功能。
【圖文】：

用熒光實(shí)時(shí)定量PCR方法驗(yàn)證芯片分析的結(jié)果，同轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照 NCSIRNA的對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染促增殖siRNA一A281的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的舫么心基因mRNA水平顯著增高(圖1)，增高為轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照 SIRNANC的細(xì)胞的4.57士0.30倍切 <0.01)。馨馨馨之望N卜。!uo協(xié)價(jià).﨑立x.一拐劣，

本文編號(hào)：2536318