本文關(guān)鍵詞：實(shí)現(xiàn)黏附因子FimH在幽門螺桿菌中外膜展示，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：幽門螺桿菌是一種致病菌,能夠在胃粘膜長(zhǎng)期定植,導(dǎo)致胃炎、胃潰瘍甚至胃癌等嚴(yán)重胃部疾病,世界衛(wèi)生組織已經(jīng)將其列為Ⅰ類致癌原。幽門螺桿菌在世界范圍內(nèi)感染率高達(dá)50%以上,傳統(tǒng)的藥物治療方法由于費(fèi)用、副作用及耐藥株的出現(xiàn)而受到限制。開發(fā)疫苗用于預(yù)防或治療幽門螺桿菌具有重大意義,而現(xiàn)有的各種動(dòng)物評(píng)價(jià)系統(tǒng)存在一定缺陷,使用最廣泛的小鼠感染模型存在定植不穩(wěn)定的現(xiàn)象。本課題旨在通過基因敲入技術(shù)將外源黏附因子一一鼠傷寒沙門氏菌Ⅰ型菌毛黏附蛋白FimH或其黏附結(jié)構(gòu)域?qū)胗拈T螺桿菌基因組中,實(shí)現(xiàn)外源黏附因子與幽門螺桿菌自身外膜蛋白Lpp20和Omp18融合表達(dá)并在外膜展示,以增強(qiáng)幽門螺桿菌在小鼠胃腸黏膜中的定植能力。在實(shí)驗(yàn)的第一部分中,我們對(duì)幽門螺桿菌的基因打靶技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化。從培養(yǎng)基、抗生素、感受態(tài)濃度、孵育時(shí)間及同源臂長(zhǎng)度對(duì)基因打靶系統(tǒng)進(jìn)行了細(xì)致的考察。通過比較發(fā)現(xiàn)：在含血清的培養(yǎng)基中幽門螺桿菌生長(zhǎng)旺盛,相對(duì)于全血培養(yǎng)基能夠縮短打靶周期；在抗生素選擇壓力方面,卡那霉素相對(duì)于氯霉素更能夠避免假陽(yáng)性的出現(xiàn)：感受態(tài)細(xì)菌濃度在2×109cfu/ml以上時(shí)能夠得到轉(zhuǎn)化子,但在2×1010cfu/ml時(shí),可以成功獲得更多的轉(zhuǎn)化子：電擊后孵育時(shí)間為24h時(shí),轉(zhuǎn)化效率較高；在300-700bp考察范圍之內(nèi)的同源臂長(zhǎng)度對(duì)于基因敲除轉(zhuǎn)化效率影響不顯著。通過大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),二次轉(zhuǎn)涂可以極大地提高轉(zhuǎn)化率,使打靶重組子更容易獲得。構(gòu)建了四種基因敲入的打靶載體p-Lpp20-FimH、p-Lpp20-FimH(Ld)、 p-Omp18-FimH及p-Omp18-FimH(Ld),利用基因敲入技術(shù)將其導(dǎo)入到幽門螺桿菌26695中,使fimH基因或其黏附結(jié)構(gòu)域基因片段fimH(ld)與幽門螺桿菌外膜蛋白基因lpp20或omp18融合表達(dá)。利用交叉引物對(duì)其進(jìn)行基因組水平上的驗(yàn)證,證明外源基因imH或fimH(ld)已經(jīng)整合在幽門螺桿菌26695基因組指定位置：在轉(zhuǎn)錄水平上,利用RT-PCR技術(shù)對(duì)fimH或fimH(ld)的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行了驗(yàn)證,證明了lpp20-fimH, lpp20-fimH(ld), ompl8-fimH, ompl8-fimH(ld)融合基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的存在。將fimH基因表達(dá)在大腸桿菌中,獲得了FimH重組蛋白。對(duì)FimH重組包涵體蛋白進(jìn)行洗滌純化后,免疫新西蘭大耳白兔,獲得了針對(duì)FimH的多克隆抗體,抗體效價(jià)為1：10000。通過超速離心的方法提取了幽門螺桿菌26695四個(gè)重組菌株的外膜蛋白,利用Western Blot檢測(cè)外膜蛋白中FimH的表達(dá)。結(jié)果證明可以在重組菌株HP-Lpp20-FimH、HP-Lpp20-FimH(Ld)的外膜蛋白中檢測(cè)到融合蛋白Lpp20-FimH、Lpp20-FimH(Ld)的表達(dá)。利用斑點(diǎn)雜交檢測(cè)外膜蛋白,結(jié)果證明重組菌株HP-Lpp20-FimHvHP-Lpp20-FimH(Ld)、Omp18-FimH、 Omp18-Fim(1d)外膜蛋白具有FimH的與甘露糖結(jié)合活性。
【關(guān)鍵詞】：幽門螺桿菌 基因打靶 外膜展示 黏附
【學(xué)位授予單位】：北京化工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-18
• 第一章 緒論18-28
• 1.1 幽門螺桿菌疫苗現(xiàn)狀19-21
• 1.1.1 幽門螺桿菌全菌疫苗19
• 1.1.2 幽門螺桿菌亞單位疫苗19-20
• 1.1.3 核酸疫苗20
• 1.1.4 活載體疫苗20
• 1.1.5 佐劑20-21
• 1.1.6 給藥方式21
• 1.2 幽門螺桿菌疫苗評(píng)價(jià)的動(dòng)物模型21-23
• 1.2.1 靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型21-22
• 1.2.2 其他大型哺乳動(dòng)物模型22
• 1.2.3 大鼠模型22
• 1.2.4 小鼠模型22
• 1.2.5 蒙古沙鼠模型22-23
• 1.2.6 轉(zhuǎn)基因小鼠23
• 1.3 幽門螺桿菌的黏附因子23
• 1.4 外源黏附因子23-25
• 1.5 幽門螺桿菌基因打靶25-26
• 1.6 表面展示系統(tǒng)26
• 1.7 幽門螺桿菌外膜蛋白26-27
• 1.7.1 Lpp2026
• 1.7.2 Omp1826-27
• 1.8 立題依據(jù)27-28
• 第二章 幽門螺桿菌基因打靶優(yōu)化28-44
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料28-29
• 2.1.1 質(zhì)粒和菌株28
• 2.1.2 酶與試劑28-29
• 2.1.3 培養(yǎng)基及溶液29
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法29-33
• 2.2.1 幽門螺桿菌的培養(yǎng)29-30
• 2.2.2 幽門螺桿菌基因組的制備30
• 2.2.3 引物序列設(shè)計(jì)30
• 2.2.4 PCR擴(kuò)增目的基因30-31
• 2.2.5 打靶載體的構(gòu)建31-32
• 2.2.6 感受態(tài)的制備32
• 2.2.7 抗生素的選擇32
• 2.2.8 二次轉(zhuǎn)涂影響32
• 2.2.9 感受態(tài)濃度的影響32-33
• 2.2.10 孵育時(shí)間影響33
• 2.2.11 同源臂長(zhǎng)度影響33
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-41
• 2.3.1 幽門螺桿菌基因敲除技術(shù)路線33-34
• 2.3.2 同源臂的擴(kuò)增34-35
• 2.3.3 打靶載體的構(gòu)建35-36
• 2.3.4 抗生素的選擇36
• 2.3.5 二次轉(zhuǎn)涂的影響36-38
• 2.3.6 感受態(tài)濃度影響38-39
• 2.3.7 孵育時(shí)間影響39-40
• 2.3.8 同源臂長(zhǎng)度的影響40-41
• 2.4 討論41-44
• 第三章 幽門螺桿菌基改造菌株的構(gòu)建及鑒定44-68
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料44-45
• 3.1.1 質(zhì)粒與菌株44-45
• 3.1.2 酶與試劑45
• 3.2 試驗(yàn)方法45-53
• 3.2.1 幽門螺桿菌的培養(yǎng)45-46
• 3.2.2 幽門螺桿菌基因組模板的制備46
• 3.2.3 S. typhimurium基因組的制備46
• 3.2.4 引物序列設(shè)計(jì)46-47
• 3.2.5 打靶載體構(gòu)建47-48
• 3.2.6 基因敲入48
• 3.2.7 基因組水平驗(yàn)證48-49
• 3.2.8 RNA水平驗(yàn)證49-51
• 3.2.9 FimH重組表達(dá)51-52
• 3.2.10 FimH多抗制備52
• 3.2.11 外膜蛋白提取52
• 3.2.12 外膜蛋白Western Blot52
• 3.2.13 外膜蛋白斑點(diǎn)雜交52-53
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果53-64
• 3.3.1 技術(shù)路線53
• 3.3.2 基因敲入示意圖53-54
• 3.3.3 打靶載體片段擴(kuò)增54-55
• 3.3.4 打靶載體構(gòu)建55-57
• 3.3.5 基因組水平驗(yàn)證57-59
• 3.3.6 RNA水平驗(yàn)證59-62
• 3.3.7 FimH重組表達(dá)62
• 3.3.8 FimH多抗的制備62-63
• 3.3.9 Western Blot63-64
• 3.3.10 斑點(diǎn)雜交64
• 3.4 討論64-68
• 第四章 結(jié)論68-69
• 參考文獻(xiàn)69-75
• 致謝75-76
• 作者攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文76-77
• 作者和導(dǎo)師簡(jiǎn)介77-79
• 附件79-80

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 吳小茜,余菲菲;幽門螺桿菌疫苗的研究現(xiàn)狀及展望[J];福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2005年S1期

2 岳俊杰;李北平;周圍;高原;王月蘭;梁龍;;幽門螺桿菌Lpp20蛋白的生物信息學(xué)分析[J];生物技術(shù)通訊;2009年05期

3 鄒全明;;幽門螺桿菌疫苗的研究進(jìn)展[J];胃腸病學(xué);2007年09期

4 凌峰;王曉春;陳s

本文編號(hào)：253607