【摘要】：盡管WHO在全世界160多個(gè)國(guó)家進(jìn)行了BCG疫苗的接種,但是結(jié)核感染仍然高發(fā)。這種形勢(shì)一方面是由于結(jié)核耐藥菌株的出現(xiàn),從而導(dǎo)致結(jié)核治療上的困難；另一方面則與BCG疫苗的保護(hù)性下降有關(guān)。除BCG疫苗自身需改進(jìn)的因素,環(huán)境中普遍存在的非結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)的機(jī)體反應(yīng)性的改變被認(rèn)為是導(dǎo)致疫苗保護(hù)性下降的重要原因。然而這些非結(jié)核分枝桿菌通過何種方式和機(jī)制來調(diào)控機(jī)體的抗結(jié)核免疫,目前尚不清楚。 鳥分枝桿菌是一種在環(huán)境中普遍存在的機(jī)會(huì)致病菌。鳥分枝桿菌在細(xì)胞壁的構(gòu)成上與其他種屬的細(xì)菌有著很大的差異,它的細(xì)胞壁主要由大量的脂類構(gòu)成。目前對(duì)鳥分枝桿菌及其脂類的研究主要集中在其急性感染的致病機(jī)制及其對(duì)機(jī)體抗結(jié)核免疫的影響。然而在實(shí)際生活中,人們更多的是暴露在低劑量接觸鳥分枝桿菌的環(huán)境中,這種低水平、無明顯臨床癥狀的接觸鳥分枝桿菌及其產(chǎn)物是否影響機(jī)體抗結(jié)核免疫尚未見相關(guān)的研究報(bào)道,這正是本研究擬進(jìn)行探索的工作。 在結(jié)核桿菌的致病性與免疫性中,巨噬細(xì)胞與淋巴細(xì)胞發(fā)揮著重要的作用。T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的特異性免疫是機(jī)體清除結(jié)核桿菌的決定因素,結(jié)核桿菌及其抗原成份接觸BCG致敏的淋巴細(xì)胞,可細(xì)胞毒作用殺傷感染細(xì)胞或通過釋放IFN-y激活巨噬細(xì)胞來殺傷并清除結(jié)核分枝桿菌。而巨噬細(xì)胞既是結(jié)核分枝桿菌感染并寄生的宿主細(xì)胞,也是胞內(nèi)清除細(xì)菌控制感染的效應(yīng)細(xì)胞,尤其是被T細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子激活的巨噬細(xì)胞是殺傷并清除結(jié)核桿菌的重要機(jī)制。但鳥分枝桿菌,尤其是低劑量的鳥分枝桿菌或產(chǎn)物是通過哪種細(xì)胞影響抗結(jié)核免疫尚不清楚。 我們擬以BABL/c小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,通過建立動(dòng)物或細(xì)胞模型,觀察MALs誘導(dǎo)對(duì)小鼠特異性或非特異性抗結(jié)核免疫的影響,闡明其作用的機(jī)制,并明確淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在此過程中的作用。 我們分離了小鼠腹腔巨噬細(xì)胞并成功構(gòu)建了BCG免疫小鼠模型,在此基礎(chǔ)上,我們?cè)u(píng)價(jià)了MALs對(duì)抗結(jié)核免疫的影響。我們發(fā)現(xiàn)MALs的誘導(dǎo)降低了小鼠的抗結(jié)核免疫力,減弱了小鼠對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的控制。這種免疫力的降低主要是通過減弱巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌成分和IFN-γ的反應(yīng)性來實(shí)現(xiàn)的,而對(duì)淋巴細(xì)胞反應(yīng)性的影響并不明顯。本研究證實(shí)了MALs對(duì)機(jī)體抗結(jié)核免疫的影響,并對(duì)導(dǎo)致這種影響的機(jī)制作了初步的探討,為解釋結(jié)核感染的高發(fā)和防治結(jié)核提供了新的理論依據(jù)。 第一章鳥分枝桿菌脂類的提取和鑒定 為了給后續(xù)試驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)材料以及為實(shí)驗(yàn)中劑量的選擇提供一定的依據(jù),我們利用FOLCH法[1,2,3]提取了鳥分枝桿菌的脂類成分并對(duì)其進(jìn)行了初步鑒定。同時(shí)對(duì)其內(nèi)毒素含量、有無蛋白成分、細(xì)胞毒性以及體內(nèi)外誘導(dǎo)的炎癥水平進(jìn)行了評(píng)價(jià)。 鳥分枝桿菌在Middlebrook 7H11培養(yǎng)基上生長(zhǎng)為干燥、表面粗糙、菜花樣的菌落。經(jīng)抗酸染色后,油鏡下可見抗酸染色陽性(紅色),桿狀,成團(tuán)或堆排列的細(xì)菌,其染色性和鏡下排列規(guī)則與預(yù)期相同。鱟試劑是檢測(cè)內(nèi)毒素含量的公認(rèn)方法,我們用該方法檢測(cè)了鳥分枝桿菌脂類提取物中的內(nèi)毒素含量。結(jié)果表明,鳥分枝桿菌脂類提取物中的內(nèi)毒素含量較低,經(jīng)計(jì)算每10μg脂類中內(nèi)毒素含量0.05EU,說明這種方法提取的脂類中內(nèi)毒素含量可以滿足研究的要求。用于作為溶劑對(duì)照的DMSO其內(nèi)毒素含量也符合要求。 由于我們的研究涉及免疫細(xì)胞的低反應(yīng)性,而細(xì)胞毒性對(duì)低反應(yīng)性存在影響,因此我們分別用流式細(xì)胞術(shù)和CCK-8的方法評(píng)價(jià)了鳥分枝桿菌脂類對(duì)實(shí)驗(yàn)中涉及的多種細(xì)胞的細(xì)胞活力的影響。流式結(jié)果表明,10μg/ml及以下濃度的鳥分枝桿菌脂類誘導(dǎo)后,Raw264.7細(xì)胞和小鼠脾細(xì)胞存活率與Medium和SC誘導(dǎo)組相似,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著(F=0.631 P=0.652)。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果也說明,10μg/ml及以下濃度的鳥分枝桿菌脂類誘導(dǎo)后,小鼠腹腔巨噬細(xì)胞存活率與Medium和SC誘導(dǎo)組相似,統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著(F=0.090 P=0.981)。 由于我們希望模擬現(xiàn)實(shí)生活中人們慢性接觸低劑量鳥分枝桿菌的現(xiàn)象,所以要選擇一個(gè)不會(huì)誘導(dǎo)明顯炎癥反應(yīng)的合適的體內(nèi)、體外誘導(dǎo)劑量。在體外誘導(dǎo)試驗(yàn)中,我們用0.1、0.5、1、10、20μg/mlMALs以及0.5μg/ml的LPS和LTA刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞48h后,發(fā)現(xiàn)1μg/ml及以下組誘導(dǎo)產(chǎn)生的TNF-α和IL-6水平較低(F=271.44,P=0.000；F=206.16,P=0.000),而10μg/ml及以上組可以誘導(dǎo)明顯的炎癥因子產(chǎn)生增加。對(duì)相應(yīng)基因表達(dá)水平的檢測(cè)也表明1μg/ml MALs不會(huì)誘導(dǎo)明顯的炎癥(F=213.02,P=0.000；F=564.422,P=0.000)。在體內(nèi)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中,我們用0.25、0.5、lmg的MALs和0.1mgLPS以及相應(yīng)的對(duì)照腹腔注射小鼠,6h后采集血漿標(biāo)本,檢測(cè)其中TNF-α的含量。結(jié)果表明,與陽性對(duì)照LPS相比,MALs誘導(dǎo)了很低的炎癥水平(F=38.67,P=0.001),而且這種誘導(dǎo)的低炎癥水平在24h后下降到正常水平�；谏鲜鲞@些實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們最終選擇了1μg/ml及以下組(體外)和0.5mg(體內(nèi))鳥分枝桿菌脂類作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的誘導(dǎo)劑量。 本章工作證實(shí)了鳥分枝桿菌脂類對(duì)研究中所涉及的細(xì)胞沒有明顯的細(xì)胞毒性,不影響它們的細(xì)胞活力。其中的內(nèi)毒素含量符合研究的要求。同時(shí)根據(jù)不誘發(fā)可檢出的或明顯的炎癥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則確定了后續(xù)試驗(yàn)所用的劑量。 第二章MALs降低未接種BCG小鼠巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核桿菌及產(chǎn)物的反應(yīng) 在機(jī)體的非特異性抗結(jié)核免疫中,由于特異性免疫尚未建立,淋巴細(xì)胞在其中所起作用不大,因此同時(shí)作為靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的巨噬細(xì)胞的作用就顯得尤為重要。我們以其為研究對(duì)象,在體外進(jìn)行誘導(dǎo)后評(píng)價(jià)了其對(duì)胞內(nèi)BCG的控制能力。結(jié)果表明,MALs誘導(dǎo)組,巨噬細(xì)胞胞內(nèi)BCG的數(shù)量在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均多于大腸桿菌脂類對(duì)照(E. Coli. Lipids, ELs)組和DMSO溶劑對(duì)照(solvent control, SC組(F=36.12 P=0.000)。ELISA結(jié)果顯示,MALs誘導(dǎo)后,PPD和熱滅活BCG刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α、IL-6和NO減少(PPD：F=42.63 P=0.000；F=72.38 P=0.000；F=38.71 P=0.000；BCG:F=34.15 P=0.000;F=21.00 P=0.000；F=23.86 P=0.000)。real-time PCR結(jié)果也表明,MALs誘導(dǎo)后,PPD和熱滅活BCG刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α、IL-6和NO相應(yīng)的基因表達(dá)水平明顯下降(PPD:F=54.69 P=0.000; F=24.09 P=0.000; F=31.85 P=0.000BCG：F=76.06 P=0.000；F=30.25 P=0.000；F=30.05 P=0.000),且表現(xiàn)出一定的劑量依賴關(guān)系。對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的測(cè)定結(jié)果顯示,這種差別并不是通過對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響來實(shí)現(xiàn)的,與ELs組和SC組相比,在各個(gè)時(shí)間點(diǎn),1μg/ml MALs誘導(dǎo)組巨噬細(xì)胞對(duì)BCG的吞噬能力統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著。ELISA和real-time PCR結(jié)果均表明,MALs誘導(dǎo)后,PPD和熱滅活BCG刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-αIL-6和NO及其相應(yīng)的基因表達(dá)水平都明顯減少,且表現(xiàn)出一定的劑量依賴關(guān)系。提示小劑量MALs誘導(dǎo)了巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核桿菌及其產(chǎn)物的低反應(yīng)性。 NF-κB信號(hào)通路在調(diào)控促炎癥因子和NO的產(chǎn)生中起著重要的作用,我們利用NF-κB熒光素酶報(bào)告基因研究了MALs對(duì)這條通路信號(hào)的影響。PPD和熱滅活的BCG均能誘發(fā)NF-κB控制下的熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)活性顯著增加,而MALs預(yù)處理后,它們誘導(dǎo)產(chǎn)生的熒光素酶活性顯著下降(PPD:F=18.88 P=0.002:BCG:F=11.94 P=0.000)。與此同時(shí),我們對(duì)導(dǎo)致這種NF-κB信號(hào)減弱的機(jī)制作了初步的研究。Real-time PCR和WB結(jié)果顯示,MALs誘導(dǎo)了更強(qiáng)的IRAK-M蛋白的表達(dá)。Raw264.7細(xì)胞和小鼠腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)MALs誘導(dǎo)6、12、24、48h后,其IRAK-M蛋白和IRAK-M mRNA表達(dá)水平明顯高于ELs誘導(dǎo)組和SC組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=228.36 P=0.000；F=147.54 P=0.00)。 TLR2和TLR4是巨噬細(xì)胞識(shí)別結(jié)核分支桿菌的主要模式識(shí)別受體,因此我們檢測(cè)了MALs誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞表面TLR2和TLR4的表達(dá)變化。1μg/mlMALs誘導(dǎo)后,巨噬細(xì)胞表面TLR2表達(dá)水平有所增高(F=1170.16 P=0.000；F=4.64P=0.022),而TLR4變化不明顯。MALs誘導(dǎo)后,PPD或熱滅活BCG刺激的TLR2和TLR4 mRNA表達(dá)水平也有類似現(xiàn)象。與SC組相比,MALs誘導(dǎo)組TLR2mRNA水平在誘導(dǎo)后6h和12h明顯增加(F=66.91 P=0.000),而TLR4mRNA水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)增加不明顯(F=0.30 P=0.823)。這些結(jié)果提示,雖然巨噬細(xì)胞主要通過TLR2/4來識(shí)別結(jié)核分枝桿菌及其抗原并由此激活NF-κB通路產(chǎn)生促炎癥因子和NO,但MALs誘導(dǎo)的這條通路信號(hào)的減弱卻不是通過下調(diào)這兩種模式識(shí)別受體的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。 本章工作證實(shí)了MALs可以誘導(dǎo)未接種BCG小鼠巨噬細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌及其產(chǎn)物的反應(yīng)性降低,并減弱了巨噬細(xì)胞對(duì)胞內(nèi)BCG菌生長(zhǎng)的清除與控制。推測(cè)這種低反應(yīng)性的誘導(dǎo)可能與NF-KB信號(hào)的減弱與IRAK-M表達(dá)的增強(qiáng)有關(guān)；但與TLR2和TLR4表達(dá)無明顯關(guān)聯(lián)。這些結(jié)果提示我們,暴露于低劑量鳥分枝桿菌的環(huán)境中,雖然不會(huì)出現(xiàn)明顯的臨床表現(xiàn),但有可能使機(jī)體對(duì)再次的結(jié)核分枝桿菌的感染反應(yīng)性降低。 第三章MALs對(duì)小鼠特異性抗結(jié)核免疫反應(yīng)的影響 為了研究MALs對(duì)特異性抗結(jié)核免疫的影響,我們建立了BCG免疫小鼠并以PPD刺激的足墊反應(yīng)和脾細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ的水平為評(píng)價(jià)指標(biāo)的模型。結(jié)果顯示BCG免疫后的小鼠足墊厚度的增加量明顯高于未免疫小鼠(t=12.39P=0.000),PPD刺激的IFN-γ產(chǎn)生也明顯高于未免疫小鼠(t=33.82 P=0.000)。提示BCG接種的小鼠具備了針對(duì)結(jié)核分枝桿菌及其產(chǎn)物的特異性免疫,該模型可以用于后續(xù)的研究。 已知BCG除了可以作為疫苗使用外,還被作為結(jié)核分枝桿菌的替代品用于評(píng)估機(jī)體的抗結(jié)核免疫。我們用0.5mg的MALs腹腔誘導(dǎo)BCG免疫小鼠后,再次用BCG進(jìn)行攻擊。對(duì)肝臟和肺臟中的細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果顯示,MALs誘導(dǎo)小鼠的肺臟和肝臟中的BCG數(shù)量明顯高于ELs組和SC組(F=27.32P=0.000；F=29.51 P=0.000)。對(duì)其肺臟切片的HE染色結(jié)果顯示MALs誘導(dǎo)組的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯多于ELs與SC對(duì)照,提示MALs誘導(dǎo)明顯減弱了免疫小鼠對(duì)BCG感染的控制能力。以上結(jié)果證實(shí)鳥分枝桿菌脂類的誘導(dǎo)可以降低機(jī)體的特異性抗結(jié)核免疫,減弱控制結(jié)核分枝桿菌感染的能力。 對(duì)于已進(jìn)行BCG免疫接種并建立了特異性免疫的小鼠,無疑其淋巴細(xì)胞在抗結(jié)核免疫中應(yīng)該發(fā)揮著重要的主導(dǎo)作用。我們?cè)茰y(cè)MALs誘導(dǎo)的抗結(jié)核免疫的減弱很可能與淋巴細(xì)胞的免疫反應(yīng)性變化有關(guān)。為此,我們用MALs對(duì)BCG免疫小鼠進(jìn)行體內(nèi)誘導(dǎo)后,分離其脾細(xì)胞,用PPD和熱滅活BCG刺激,通過IFN-γ產(chǎn)生和淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)加以評(píng)價(jià)。令人意外的是,MALs誘導(dǎo)對(duì)PPD和熱滅活的BCG刺激的IFN-γ產(chǎn)生和淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)與ELs誘導(dǎo)組及SC組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。為了進(jìn)一步證實(shí)淋巴細(xì)胞反應(yīng)性的改變,我們分離了BCG免疫小鼠的脾細(xì)胞,用MALs進(jìn)行體外誘導(dǎo)12和24h后,再用PPD和熱滅活的BCG進(jìn)行刺激。結(jié)果同樣表明,MALs體外誘導(dǎo)后,PPD和熱滅活的BCG刺激的IFN-y產(chǎn)生與ELs誘導(dǎo)組及SC組相比統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著(PPD:F=0.18P=0.906；F=1.47 P=0.323BCG:F=0.48 P=0.698; F=0.83 P=0.504)。這些結(jié)果說明,MALs誘導(dǎo)的抗結(jié)核特異性免疫反應(yīng)性的降低與淋巴細(xì)胞無明顯關(guān)系。 在抗結(jié)核特異性免疫的重要效應(yīng)機(jī)制之一是通過活化淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ激活巨噬細(xì)胞發(fā)揮殺菌作用。因此,我們也重點(diǎn)觀察了巨噬細(xì)胞對(duì)IFN-γ的反應(yīng)性。結(jié)果顯示,MALs的預(yù)處理顯著降低了IFN-γ誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的殺菌效應(yīng),減弱了其對(duì)胞內(nèi)細(xì)菌的控制能力(F=54.60 P=0.000)。我們的研究還證實(shí)了MALs誘導(dǎo)影響IFN-γ刺激的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和NO,而TNF-α和NO在其對(duì)胞內(nèi)細(xì)菌的清除中發(fā)揮著極為重要作用。與ELs組和SC組相比,MALs誘導(dǎo)組IFN-γ刺激的巨噬細(xì)胞TNF-α和NO的產(chǎn)生明顯降低(F=10.65 P=0.004；F=32.41 P=0.000)。而另一個(gè)影響IFN-γ誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞清除胞內(nèi)細(xì)菌的重要機(jī)制是LRG-47,我們通過Real-time PCR的方法在體外評(píng)價(jià)了MALs對(duì)IFN-γ刺激的巨噬細(xì)胞LRG-47表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示與ELs組和SC組相比,MALs誘導(dǎo)組IFN-γ刺激的巨噬細(xì)胞LRG-47 mRNA的表達(dá)并沒有明顯變化(F=0.079P=0.969)。 本章工作證實(shí)了MALs可以降低獲得性抗結(jié)核免疫,減弱機(jī)體對(duì)結(jié)核分枝桿菌的控制。初步的機(jī)制探索工作證實(shí),MALs誘導(dǎo)的效應(yīng)并不是通過改變BCG免疫小鼠淋巴細(xì)胞對(duì)結(jié)核分枝桿菌及其抗原的特異性反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的,而是通過降低小鼠巨噬細(xì)胞對(duì)IFN-γ的反應(yīng)性來影響其對(duì)細(xì)菌的清除。 綜上,本研究證實(shí)了低劑量MALs體內(nèi)外誘導(dǎo)可影響未接種BCG與免疫接種BCG小鼠對(duì)細(xì)胞內(nèi)與體內(nèi)結(jié)核桿菌的清除,降低對(duì)結(jié)核桿菌及其產(chǎn)物的炎癥細(xì)胞因子生成,減弱了BCG接種對(duì)細(xì)菌攻擊肺部的保護(hù)力。MALs降低小鼠對(duì)結(jié)核桿菌的清除反應(yīng)主要是通過影響巨噬細(xì)胞胞內(nèi)清除細(xì)菌的能力,尤其是特異性免疫反應(yīng)中對(duì)IFN-γ的反應(yīng)性。上述發(fā)現(xiàn)可望為闡明普遍接種BCG情況下的結(jié)核感染高發(fā)的原因提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【圖文】：

UnderamieroscoPe. 1.2.2MALs中內(nèi)毒素含量和蛋白成分的檢測(cè)如圖1一2左圖顯示，MALS中的內(nèi)毒素含量較低，經(jīng)計(jì)算每100雌脂類中內(nèi)毒素含量<0.05EU。用于作為溶劑對(duì)照的DMSO其內(nèi)毒素含量也符合要求。以LPS作為陽性對(duì)照，MALS的內(nèi)毒素含量符合要求，，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。MALs的sDS一隊(duì)GE結(jié)果顯示20協(xié)g鳥分枝桿菌脂類中未檢出可見的蛋白成分(圖1一2右圖)。提示MALS純度符合實(shí)驗(yàn)要求。

Fig.l一2.Endoto勸 neoneentrationinMALsandidentifieationofMALsbySDS一PAGE 1.23MALs細(xì)胞毒性的評(píng)價(jià)如圖1一3所示，流式結(jié)果表明，10雌/nil及以下濃度的鳥分枝桿菌脂類誘導(dǎo)后，RaW264.7細(xì)胞存活率與Medium和SC誘導(dǎo)組相似，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著(F一0.63P一0.652)。ccK一8法檢測(cè)結(jié)果說明，10陀/m1及以下濃度的鳥分枝桿菌脂類誘導(dǎo)后，小鼠腹腔巨噬細(xì)胞存活率與Mediuln和SC誘導(dǎo)組相似，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著(F=0.09P一0.981)。圖1一4流式結(jié)果顯示，10林g/ml及以下濃度的鳥分枝桿菌脂類誘導(dǎo)后
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R392.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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本文編號(hào)：2531445