本文關(guān)鍵詞：旋毛蟲排泄分泌抗原基因Ts-ES-1的免疫篩選及其重組蛋白誘導(dǎo)小鼠免疫保護(hù)性的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：旋毛蟲病是由旋毛形線蟲引起的一種食源性人畜共患寄生蟲病。人體感染旋毛蟲病主要因食入含囊包幼蟲的肉類及其制品。旋毛蟲病的臨床癥狀復(fù)雜多樣，病原診斷比較困難，且藥物治療不能解決寄生蟲的反復(fù)感染。目前仍無(wú)有效的旋毛蟲病疫苗問世。因此，研制有效的疫苗是旋毛蟲病防治中亟待解決的問題。 采用免疫學(xué)篩選法從cDNA文庫(kù)中釣取基因片段，是尋找旋毛蟲病疫苗候選抗原分子的有效方法之一，本實(shí)驗(yàn)利用人工感染豬血清篩選了旋毛蟲成蟲cDNA文庫(kù)。篩選獲得的陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序和序列分析后，選取一編碼旋毛蟲排泄分泌抗原的基因進(jìn)行克隆表達(dá)，并用其重組蛋白免疫BALB/c小鼠，對(duì)其免疫學(xué)特性及誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫保護(hù)性作用開展研究。 首先，本實(shí)驗(yàn)用感染豬血清對(duì)旋毛蟲成蟲cDNA文庫(kù)進(jìn)行了篩選，通過三輪篩選，獲得陽(yáng)性克隆42個(gè)。對(duì)篩選結(jié)果進(jìn)行了序列分析。序列分析和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果顯示，8-3-4克隆的插入片段全長(zhǎng)700bp，，開放閱讀框（ORF）為516bp，其編碼的蛋白質(zhì)由172個(gè)氨基酸組成，理論分子量19.7kDa。通過軟件預(yù)測(cè)，該蛋白1~21aa為信號(hào)肽序列，在體外表達(dá)時(shí)，應(yīng)去除信號(hào)肽序列，表達(dá)22~172aa，共151aa，理論分子量17.3kDa。同源性比較顯示，該基因編碼的蛋白與旋毛蟲一假定蛋白同源性100%，與偽旋毛蟲的一個(gè)21kDa排泄分泌抗原（excretory/secretory，ES）同源性達(dá)79%。綜合上述結(jié)果，推斷此基因編碼的蛋白為排泄分泌蛋白，命名為Ts-ES-1。 為獲得Ts-ES-1基因編碼的蛋白并進(jìn)一步鑒定其免疫學(xué)特性，我們將基因的ORF去除信號(hào)肽后（453bp）與原核表達(dá)載體pET-28a(+)進(jìn)行構(gòu)建并進(jìn)行蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白（rTs-ES-1）分子量約為24kDa（含載體攜帶的組氨酸標(biāo)簽），與理論值相符。經(jīng)鎳柱親和層析純化和復(fù)性后，獲得純度較高的rTs-ES-1。 將純化的rTs-ES-1隔周免疫BALB/c小鼠，免疫三次后，取rTs-ES-1免疫血清。經(jīng)ELISA鑒定，小鼠體內(nèi)產(chǎn)生了針對(duì)rTs-ES-1的高滴度特異性IgG抗體。Western blot結(jié)果顯示，病鼠、病豬、病兔以及病人血清均能識(shí)別rTs-ES-1，提示rTs-ES-1具有較好的免疫原性和抗原特異性。免疫熒光定位分析證實(shí)，Ts-ES-1分布在旋毛蟲桿狀體的桿狀細(xì)胞內(nèi)。通過RT-PCR表明在旋毛蟲成蟲及肌幼蟲體內(nèi)均有Ts-ES-1基因的轉(zhuǎn)錄；Western blot顯示，rTs-ES-1免疫血清與旋毛蟲肌幼蟲和成蟲的蟲體抗原以及ES抗原均發(fā)生反應(yīng)，在約20kDa處出現(xiàn)識(shí)別條帶，表明rTs-ES-1既存在于天然蟲體抗原中，又存在于旋毛蟲的ES抗原中。此結(jié)果進(jìn)一步說明rTs-ES-1是旋毛蟲排泄分泌抗原的組分。 其次，為評(píng)價(jià)rTs-ES-1誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫保護(hù)作用，本實(shí)驗(yàn)將BALB/c小鼠隨機(jī)分為三組，用rTs-ES-1與佐劑ISA50V2混合免疫小鼠作為rTs-ES-1免疫組；PBS與佐劑ISA50V2混合免疫及單純PBS免疫作為對(duì)照組；隔周免疫一次，共免疫三次。于末次免疫后2周，每只小鼠經(jīng)口攻擊感染旋毛蟲肌幼蟲500條。分別在攻蟲后5天和攻蟲后45天評(píng)價(jià)成蟲減蟲率和肌幼蟲減蟲率，結(jié)果顯示，與PBS對(duì)照組及單純佐劑組比較，rTs-ES-1免疫組獲得了27%的成蟲減蟲率和42.1%的肌幼蟲減蟲率（p0.01）。 最后，為探討rTs-ES-1免疫小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫保護(hù)性的機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)用ELISA法對(duì)小鼠血清中總IgG和IgG抗體亞型（IgG1、IgG2a）的水平進(jìn)行了檢測(cè)，同時(shí)利用ELISPOT檢測(cè)了小鼠脾淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-5）的水平。結(jié)果顯示，與PBS對(duì)照組和單純佐劑組相比，rTs-ES-1免疫組小鼠血清中產(chǎn)生的抗rTs-ES-1特異性抗體IgG和IgG抗體亞型（IgG1、IgG2a）的水平均明顯升高（p0.01），其中IgG1較IgG2a升高更為明顯。以rTs-ES-1作為刺激物，與PBS對(duì)照組及單純佐劑組相比，rTs-ES-1免疫組小鼠脾細(xì)胞分泌Th1型細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2及Th2型細(xì)胞因子IL-4和IL-5均明顯升高。 通過上述實(shí)驗(yàn)，我們獲得旋毛蟲排泄分泌蛋白Ts-ES-1基因及其原核表達(dá)的重組蛋白rTs-ES-1。rTs-ES-1免疫小鼠后可誘導(dǎo)產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)力，成蟲和肌幼蟲減蟲率分別為27%和42.1%。同時(shí)，rTs-ES-1可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生以Th2反應(yīng)為主的Th1/Th2混合型免疫應(yīng)答。以上結(jié)果表明，rTs-ES-1可作為抗旋毛蟲病的疫苗候選抗原分子，為抗旋毛蟲病疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：旋毛蟲 排泄分泌蛋白 Ts-ES-1 免疫保護(hù)性
【學(xué)位授予單位】：首都醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R383.15;R392
【目錄】：

• 英文縮略詞表6-8
• 摘要8-11
• Abstract11-15
• 前言15-18
• 第一部分：旋毛蟲排泄分泌蛋白 Ts-ES-1 基因的免疫篩選、克隆表達(dá)及免疫學(xué)鑒定18-63
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料18-20
• 2. 主要溶液的配置20-25
• 3. 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備25-27
• 4. 實(shí)驗(yàn)流程圖27-28
• 5. 實(shí)驗(yàn)方法28-48
• 5.1 旋毛蟲成蟲 cDNA 文庫(kù)的免疫篩選28-31
• 5.2 陽(yáng)性克隆的序列測(cè)定及分析31
• 5.3 旋毛蟲排泄分泌蛋白 Ts-ES-1 基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建31-37
• 5.4 重組質(zhì)粒（pET-28a(+)/Ts-ES-1）的誘導(dǎo)表達(dá)37-39
• 5.5 重組蛋白 rTs-ES-1 的純化39-41
• 5.6 重組蛋白 rTs-ES-1 的復(fù)性41-42
• 5.7 Western Blot 鑒定42-43
• 5.8 重組蛋白 rTs-ES-1 的免疫學(xué)鑒定43-44
• 5.9 Ts-ES-1 在旋毛蟲不同發(fā)育階段的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)44-46
• 5.10 免疫熒光定位46-48
• 6. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果48-62
• 6.1 旋毛蟲成蟲 cDNA 文庫(kù)的免疫篩選及陽(yáng)性克隆的鑒定48
• 6.2 序列測(cè)定及生物信息學(xué)分析48-52
• 6.3 重組質(zhì)粒（pET-28a(+)/Ts-ES-1）的構(gòu)建52-54
• 6.4 重組質(zhì)粒（pET-28a(+)/Ts-ES-1）的原核表達(dá)54-57
• 6.5 rTs-ES-1 的初步鑒定57-58
• 6.6 rTs-ES-1 的免疫學(xué)特性58-59
• 6.7 旋毛蟲不同發(fā)育階段 Ts-ES-1 的表達(dá)59-60
• 6.8 免疫熒光定位60-62
• 7. 小結(jié)62-63
• 第二部分：旋毛蟲重組排泄分泌蛋白（rTs-ES-1）免疫小鼠產(chǎn)生免疫保護(hù)性及其機(jī)制的初步探討63-81
• 1. 實(shí)驗(yàn)材料63-64
• 2. 主要試劑的配制64-66
• 3. 實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備66-67
• 4. 實(shí)驗(yàn)流程圖67-68
• 5. 實(shí)驗(yàn)方法68-73
• 5.1 rTs-ES-1 免疫小鼠實(shí)驗(yàn)方案68
• 5.2 rTs-ES-1 免疫保護(hù)性評(píng)價(jià)68-69
• 5.3 ELISA 法測(cè)定小鼠特異性血清抗體 IgG 效價(jià)69-70
• 5.4 ELISPOT 檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的淋巴細(xì)胞70-72
• 5.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法72-73
• 6. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果73-80
• 6.1 重組蛋白 rTs-ES-1 免疫小鼠產(chǎn)生的免疫保護(hù)作用73-76
• 6.2 免疫后小鼠體內(nèi)抗 rTs-ES-1 IgG 抗體效價(jià)變化76-77
• 6.3 rTs-ES-1 免疫組小鼠血清 IgG1/IgG2a 抗體亞型分析77
• 6.4 ELISPOT 檢測(cè)細(xì)胞因子的分泌水平77-80
• 7. 小結(jié)80-81
• 討論81-88
• 參考文獻(xiàn)88-96
• 文獻(xiàn)綜述96-114
• 參考文獻(xiàn)104-114
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況114-115
• 致謝115-116
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷116

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10 王U

本文編號(hào)：252873