本文關(guān)鍵詞：Kallistatin蛋白的哺乳動(dòng)物表達(dá)、純化及單克隆抗體制作初探，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人組織激肽釋放酶結(jié)合蛋白(Kallistatin,Kal),作為一種絲氨酸蛋白酶抑制劑,在炎癥反應(yīng)、血管生成以及損傷修復(fù)等多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要的作用。本課題組前期研究表明,Kal具有良好的抗肝纖維化的作用,可以抑制大鼠肝星狀細(xì)胞的活化,下調(diào)星狀細(xì)胞中的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)的表達(dá),并且抑制H202誘導(dǎo)的星狀細(xì)胞活性氧的形成。同時(shí)發(fā)現(xiàn)Kal可以作為肝纖維化診斷指標(biāo)來(lái)對(duì)肝臟健康狀況進(jìn)行有效檢測(cè),并申報(bào)國(guó)家專利。本研究是在Kal確定可以作為肝纖維化診斷試劑研發(fā)基礎(chǔ)上的自然延伸,旨在創(chuàng)建一個(gè)以Kallistatin為指標(biāo)的肝纖維化分子診斷ELISA試劑盒。本研究根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生部關(guān)于臨床診斷試劑盒制作標(biāo)準(zhǔn)來(lái)設(shè)計(jì)、推進(jìn)。即當(dāng)前臨床上所用試劑盒除了對(duì)抗體進(jìn)行檢測(cè)外的試劑盒均為是使用雙抗體夾心法,在檢測(cè)抗體上加入生物素-鏈霉親合素系統(tǒng)。本研究首先采用畢赤酵母發(fā)酵法和哺乳動(dòng)物表達(dá)獲取Kal蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:畢赤酵母表達(dá)的Kal蛋白糖基化水平不足,與天然的蛋白質(zhì)有一定的差異,無(wú)法采用。故本研究采用酵母發(fā)酵和哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)獲得的Kal蛋白進(jìn)一步探索。本研究結(jié)果顯示:通過酵母發(fā)酵可獲得較高純度的重組Kal蛋白,使用該蛋白制作抗體時(shí),發(fā)現(xiàn)其Kal蛋白免疫原性較差,所以進(jìn)行免疫時(shí)使用40μg/mL的Kal與弗氏佐劑1:1混合后,免疫效果呈現(xiàn)最佳效果。使用脾內(nèi)免疫與皮下免疫方法對(duì)比后發(fā)現(xiàn)皮下免疫雖然時(shí)間較長(zhǎng),但是效價(jià)較高,適合作為單克隆抗體制作的方法。在此基礎(chǔ)上,本研究還構(gòu)建了Kal哺乳動(dòng)物表達(dá)載體,并使用該載體探索在CHO細(xì)胞里高效表達(dá),同時(shí)進(jìn)行條件優(yōu)化。這對(duì)于制作一個(gè)高靈敏度臨床應(yīng)用的肝纖維化Kal診斷試劑盒提供了參考依據(jù),為臨床應(yīng)用Kal-ELISA試劑盒提供前期基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：Kallistatin 哺乳動(dòng)物表達(dá) CHO細(xì)胞 單抗 臨床應(yīng)用
【學(xué)位授予單位】：華僑大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 主要符號(hào)對(duì)照表9-10
• 第一章 引言10-11
• 第二章 研究目的與意義11-18
• 2.1 Kallistatin概述11-18
• 2.1.1 組織激肽釋放酶結(jié)合蛋白11-13
• 2.1.2 肝纖維化13-15
• 2.1.3 肝纖維化的診斷15
• 2.1.4 肝纖維化的治療15-18
• 第三章 Kallistatin蛋白的畢赤酵母表達(dá)及純化18-27
• 3.1 畢赤酵母表達(dá)Kal蛋白18-20
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料18
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑18
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器18-19
• 3.1.4 試劑配制19
• 3.1.5 實(shí)驗(yàn)方法19-20
• 3.2 Kal蛋白的純化定性及定量20-22
• 3.2.1 試劑配制20-21
• 3.2.2 目的蛋白的純化21
• 3.2.3 SDA-PAGE電泳檢測(cè)21-22
• 3.2.4 Western Blot鑒定目的蛋白22
• 3.2.5 BCA法測(cè)定總蛋白濃度22
• 3.2.6 Elisa法測(cè)定目的蛋白濃度22
• 3.3 統(tǒng)計(jì)分析22
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析22-27
• 3.4.1 重組人組織激肽釋放酶結(jié)合蛋白的制備22-24
• 3.4.2 重組人組織激肽釋放酶結(jié)合蛋白的純化24
• 3.4.3 SDS-PAGE鑒定24-27
• 第四章 Kallistatin哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的構(gòu)建27-35
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料27-28
• 4.1.1 試劑及耗材準(zhǔn)備27
• 4.1.2 培養(yǎng)基及溶液的配制27-28
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法28-32
• 4.2.1 引物設(shè)計(jì)28
• 4.2.2 T載的構(gòu)建與鑒定28-30
• 4.2.3 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化及藍(lán)白斑篩選30
• 4.2.4 質(zhì)粒的小量提取30-31
• 4.2.5 測(cè)序31
• 4.2.6 雙酶切后的目的片段連接到pcDNA3.1(+)載體31-32
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析32-34
• 4.3.1 pcDNA3.1-Kal載的構(gòu)建與鑒定32-33
• 4.3.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果33-34
• 4.4 討論34-35
• 第五章 Kallistatin蛋白哺乳動(dòng)物表達(dá)初探35-50
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料35
• 5.2 CHO細(xì)胞凍存與復(fù)蘇的條件優(yōu)化35-36
• 5.1.1 凍存保護(hù)液對(duì)CHO細(xì)胞的影響35
• 5.1.2 凍存條件對(duì)CHO細(xì)胞的影響35-36
• 5.1.3 復(fù)蘇方法對(duì)CHO細(xì)胞存活率的影響36
• 5.3 PEI介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化36-37
• 5.3.1PEI毒性試驗(yàn)36
• 5.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法36
• 5.3.3 轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化36-37
• 5.4 結(jié)果37-44
• 5.4.1 保存和復(fù)蘇條件的優(yōu)化37-40
• 5.4.2 轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化40-44
• 5.5 討論44-50
• 5.5.1 宿主細(xì)胞的選擇45-46
• 5.5.2 表達(dá)載體的選擇46
• 5.5.3 轉(zhuǎn)染試劑的選擇46-48
• 5.5.4 轉(zhuǎn)染過程的優(yōu)化48
• 5.5.5 質(zhì)粒的抽提及純化48-50
• 第六章 Kallistatin蛋白單克隆抗體制作初探50-59
• 6.1 實(shí)驗(yàn)材料50
• 6.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物50
• 6.1.2 試劑與器材50
• 6.2 實(shí)驗(yàn)方法50-51
• 6.2.1 脾內(nèi)免疫50
• 6.2.2 皮下免疫50
• 6.2.3 細(xì)胞融合50-51
• 6.2.4 血清滴度檢測(cè)51
• 6.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析51-53
• 6.3.1 脾內(nèi)免疫與皮下免疫結(jié)果對(duì)比51-52
• 6.3.2 抗原使用量及佐劑優(yōu)化實(shí)驗(yàn)52-53
• 6.4 討論53-59
• 6.4.1 細(xì)胞融合前的準(zhǔn)備54-55
• 6.4.2 飼養(yǎng)細(xì)胞的制備55
• 6.4.3 細(xì)胞融合的主要方法55-56
• 6.4.4 雜交瘤細(xì)胞的篩選56
• 6.4.5 克隆化技術(shù)56-57
• 6.4.6 單克隆雜交瘤細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)57-58
• 6.4.7 無(wú)血清培養(yǎng)液在雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用58
• 6.4.8 雜交瘤細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇58
• 6.4.9 單抗的效價(jià)鑒定及純化58-59
• 第七章 討論與展望59-61
• 7.1 畢赤酵母蛋白的表達(dá)59
• 7.2 哺乳動(dòng)物表達(dá)59
• 7.3 小鼠抗體制作59
• 7.4 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)59-60
• 7.5 未來(lái)研究計(jì)劃60-61
• 參考文獻(xiàn)61-65
• 致謝65

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本文編號(hào)：252847