發(fā)布時(shí)間：2017-03-17 19:01

  本文關(guān)鍵詞：抑制PARP-1改善衰老導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景：大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)衰老導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)與活性氧(ROS)和活性氮(RNS)的過(guò)度產(chǎn)生和一氧化氮生物利用度降低有關(guān)。氧化應(yīng)激最大的危害是損傷細(xì)胞DNA而且還能激活聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1(PARP-1)。持續(xù)氧化應(yīng)激引起的DNA損傷可以導(dǎo)致PARP-1的過(guò)度激活。近期有實(shí)驗(yàn)表明PARP-1參與炎癥反應(yīng)。PARP-1的過(guò)度表達(dá)提示存在DNA損傷,這與內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)有著緊密聯(lián)系,但迄今為止,關(guān)于PARP-1和衰老內(nèi)皮細(xì)胞功能聯(lián)系的研究罕有報(bào)道,本研究利用自然衰老的小鼠,探討抑制PARP-1在保護(hù)衰老內(nèi)皮細(xì)胞功能中的作用。研究目的：1.探討抑制PARP-1對(duì)衰老內(nèi)皮功能的影響2.探討抑制PARP-1改善內(nèi)皮細(xì)胞功能的機(jī)制研究方法：1.動(dòng)物模型的建立野生型雄性小鼠和PARP-1基因敲除小鼠分別被分成年輕組(2個(gè)月)和衰老組(12個(gè)月)并測(cè)量相關(guān)生化指標(biāo)。2.動(dòng)物血管功能檢測(cè)把主動(dòng)脈切成3mm-4mm的動(dòng)脈環(huán),每個(gè)環(huán)都連接到等力測(cè)距傳感器上。血管環(huán)被去甲腎上腺素預(yù)先刺激,之后測(cè)定對(duì)乙酰膽堿和硝普鈉的反應(yīng)。3.實(shí)時(shí)定量PCR提取主動(dòng)脈組織RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR,測(cè)定β-actin,PARP-1, eNOS, iNOS, Arg2的mRNA水平。4.細(xì)胞培養(yǎng)以及衰老細(xì)胞模型的建立使用AngⅡ刺激人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)衰老,使用LY294002, BAY11-7082,和DPQ來(lái)抑制Akt,NF-KB and PARP-1的活性。使用β半乳糖甘酶染色來(lái)檢測(cè)衰老模型。5.蛋白印跡提取各組細(xì)胞與各組組織的總蛋白,分別檢測(cè)PARP-1, p-eNOS, eNOS, iNOS, AKT, p-AKT, p16, p21等蛋白的表達(dá)量。6.NO水平及ROS水平檢測(cè)動(dòng)物血清NO水平使用NO檢測(cè)試劑盒及分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)和測(cè)量。主動(dòng)脈和細(xì)胞ROS水平使用DHE染色試劑盒和DCFH-DA染色試劑盒進(jìn)行測(cè)定。7.免疫熒光使用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)NF-kb的核轉(zhuǎn)位情況。8.使用spss12進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理,用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示(mean±SD)。研究結(jié)果：1.PARP-1在不同年齡的小鼠中的表達(dá)變化：在野生型小鼠中,衰老組PARP-1表達(dá)水平升高,而PARP-1敲除組中則幾乎沒(méi)有表達(dá)。2.衰老組血管功能的改變：野生型衰老小鼠主動(dòng)脈對(duì)乙酰膽堿的敏感性明顯下降,而敲除PARP-1的衰老小鼠能明顯改善主動(dòng)脈對(duì)乙酰膽堿的敏感性,但是它們對(duì)硝普鈉的反應(yīng)卻沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3小鼠血NO水平及主動(dòng)脈組織ROS水平檢測(cè)：相對(duì)于野生型年輕小鼠,野生型衰老小鼠NO水平、ROS水平明顯下降,敲除PARP-1后能改善這種變化。4小鼠主動(dòng)脈組織eNOS, p-enos(Thr454), iNOS及Arg2的蛋白表達(dá)：相對(duì)于野生型年輕小鼠,野生型衰老小鼠iNOS及Arg2的蛋白表達(dá)增高,敲除PARP-1后能改善這種變化,但是eNOS卻沒(méi)有改變。之后測(cè)定了p-enos(Thr454)的表達(dá),與野生型年輕小鼠相比,野生型衰老小鼠p-enos(Thr454)的蛋白表達(dá)降低,敲除PARP-1后同樣也能改善這種變化。5.衰老細(xì)胞模型的建立及檢測(cè)衰老細(xì)胞PARP-1的表達(dá)：使用AngⅡ誘導(dǎo)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞,p半乳糖苷酶和P16 P21檢測(cè)模型建立,發(fā)現(xiàn)AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞p半乳糖苷酶和P16 P21的表達(dá)顯著升高,說(shuō)明模型建立成功。與正常細(xì)胞相比,AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞PARP-1表達(dá)升高。6.檢測(cè)細(xì)胞ROS水平和NO水平：AngⅡ誘導(dǎo)的細(xì)胞ROS表達(dá)增高而上清液NO水平下降。7.AngⅡ通過(guò)AKT通道改變PARP-1的表達(dá)：同時(shí)用AngⅡ和AKT通道抑制劑刺激細(xì)胞比單獨(dú)使用AngⅡ刺激細(xì)胞,PARP-1的表達(dá)降低程度更明顯。8.PARP-1抑制劑和NF-kb抑制劑能減少iNOS的表達(dá)增加P-eNOS (Thr454)的表達(dá)：與單獨(dú)使用AngⅡ刺激細(xì)胞相比,同時(shí)用AngⅡ與PARP-1抑制劑和AngⅡ與NF-kb抑制劑刺激細(xì)胞后iNOS的表達(dá)明顯降低,但是對(duì)eNOS的表達(dá)沒(méi)有顯著影響,P-eNOS (Thr454)的表達(dá)顯著升高。9.PARP-1抑制劑通過(guò)阻止NF-kb的核轉(zhuǎn)位減少iNOS的表達(dá)：免疫熒光顯示AngⅡ能誘導(dǎo)NF-kb的核轉(zhuǎn)位,但是加入了 PARP-1抑制劑后能阻止NF-kb核轉(zhuǎn)位的發(fā)生。研究結(jié)論：1. PARP-1抑制劑能通過(guò)調(diào)節(jié)iNOS的表達(dá)來(lái)改善衰老引起的內(nèi)皮細(xì)胞功能的失調(diào)2.抑制PARP-1的表達(dá)也許會(huì)成為治療衰老血管功能失調(diào)的新的方向
【關(guān)鍵詞】：衰老 內(nèi)皮細(xì)胞功能 一氧化氮合酶 聚二磷酸腺苷核糖聚合酶1
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R339.38
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符號(hào)說(shuō)明13-15
• 前言15-18
• 材料與方法18-32
• 結(jié)果32-37
• 討論37-43
• 創(chuàng)新點(diǎn)與限制性43-44
• 結(jié)論44-45
• 附錄45-53
• 參考文獻(xiàn)53-59
• 致謝59-60
• 攻讀碩士期間撰寫(xiě)與發(fā)表的論文60-61
• 附件61

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  本文關(guān)鍵詞：抑制PARP-1改善衰老導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：253279