【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)屬嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)正嗜肝DNA病毒屬,HBV感染嚴重威脅人類生命健康,可引起急、慢性肝炎、肝衰竭、肝硬化、肝癌以致死亡。全球約有30億人曾經(jīng)感染過HBV,將近3.5億人為慢性HBV感染者。我國1992年和2006年全國HBV感染血清流行病學結果顯示,隨著乙肝疫苗預防接種納入新生兒計劃免疫后,一般人群的HBsAg陽性率已經(jīng)明顯下降,從92年的9.75%下降到06年的7.18%,使我國由原來的高流行區(qū)降為中度流行區(qū),但仍可推算出約9300萬乙肝攜帶者,其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者約有2000萬例。在《中國病毒性肝炎的流行現(xiàn)狀及其相關問題分析報告》中估算出我國每年因慢性乙肝(包括肝硬化、肝癌)的直接和間接醫(yī)療費用約6000億元,給患者和國家造成了巨大的經(jīng)濟負擔。 乙型肝炎治療任重而道遠,在針對乙型肝炎的治療藥物中,諸如干擾素、胸腺肽α1、核苷類似物、多肽類藥物、治療性疫苗及中草藥等,到目前為止,尚未發(fā)現(xiàn)能夠根除乙肝病毒的藥物。目前應用于臨床的高效價免疫球蛋白(HBIG)采用健康人即抗-HBsAg陽性的人血制備的,可以中和并清除侵入人體的乙肝病毒,使機體免受乙肝病毒的感染。由于血源來源有限、制備成本高且存在病原體潛在感染的危險,限制了其在臨床上的應用�？贵w庫技術能夠篩選出高親和力的特異性單克隆抗體,從而使大規(guī)模生產(chǎn)人源化乙肝抗體成為可能�；诖�,本研究中篩選人源抗HBsAg抗體包括以下三部分內(nèi)容： 一、人源抗乙型肝炎病毒表面抗原Fab噬菌體抗體庫的構建和篩選 選取5名乙肝表面抗體(HBsAb+)陽性的健康志愿者,接種國產(chǎn)乙肝疫苗進行加強免疫,兩周后采集志愿者外周血并分離出淋巴細胞,提取細胞總RNA,使用Oligo dT引物逆轉錄合成cDNA,利用特異性的8對Lambda輕鏈子庫引物、5對Kappa輕鏈子庫引物和8對重鏈引物擴增出輕重鏈Fd片段,輕鏈和重鏈分別通過SacⅠ/XbaⅠ和Xhol/SpeⅠ酶切位點克隆到pComb3H載體中,成功電轉構建4個Kappa子庫和Lambda子庫,細菌抗體庫鑒定結果表明所構建Fab噬菌體抗體庫庫容量達到3×108以上,抗體基因插入率接近100%,符合篩庫的標準。 在成功構建了噬菌體抗體庫的基礎上,采用輔助噬菌體VCSM13包裝成Fab噬菌體抗體庫,利用商品化的乙肝表面抗原蛋白對抗體庫進行富集篩選。并通過序列測定確定所獲各株抗體的基因序列,與v-base database中抗體序列信息進行比較,確定其CDR區(qū)。序列測定結果顯示共有20株輕重鏈系列均不相同的克隆株,通過ELISA實驗證明這些抗體均為特異性HBsAg抗體,通過競爭性ELISA發(fā)現(xiàn)20株抗體可以競爭結合3個不同表位。 二、人源抗乙型肝炎病毒表面抗原全抗體表達及功能鑒定 在利用原核細胞XL1-Blue表達Fab抗體的基礎上,分別利用哺乳動物瞬時表達系統(tǒng)和桿狀病毒-昆蟲細胞技術平臺實現(xiàn)了全抗體的真核分泌表達。將篩選出的20株抗體中具有高滴度6株Fab抗體的輕鏈和重鏈Fd段基因插入桿狀病毒載體pAc-L-FcR中,然后將構建完成的重組質(zhì)粒與桿狀病毒重組后轉染昆蟲細胞,同時將其輕重鏈可變區(qū)基因插入HL51-14哺乳動物細胞表達載體后,轉染293T細胞。通過直接免疫熒光檢測真核表達效果,收集昆蟲細胞和哺乳動物細胞表達上清進行親和層析純化。利用SDS-PAGE檢測純化后抗體的純度、ELISA方法檢測純化后的抗HBsAgIgG全抗體的功能活性,結果表明純化后的人源HBsAg單克隆抗體抗體純度達到98%以上,并且具有良好的生物活性。 三、人源抗乙型肝炎病毒表面抗原IgG全抗體親和力研究 將純化后的抗HBsAg IgG全抗體分別利用非競爭性ELISA方法和BIAcoreSPR檢測方法檢測其親和力,結果顯示含有同一重鏈基因的各株抗體的親和力較高,KD值達到10-9mol/L(abbr.M),而兩種表達系統(tǒng)表達的同一株抗體的親和力活性無明顯差異。 綜上所述,本研究通過基因工程抗體制備技術平臺,運用噬菌體表面呈現(xiàn)技術,從乙肝疫苗加強免疫后的HBsAb+志愿者的外周血中獲得Fab段抗體基因,成功構建了人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗體文庫,容量為2×107克隆/ml,輕、重鏈基因插入率均接近100%。用商品化的乙肝病毒表面抗原對Fab噬菌體抗體庫進行富集篩選,經(jīng)過特異性ELISA、序列測定證實共獲得了20株特異性針對乙肝病毒表面抗原的人源Fab單抗,滴度測定后選取6株滴度較高的抗體進行全抗體表達。將重鏈基因不同的3株Fab抗體的輕鏈和重鏈Fd段基因,分別克隆入昆蟲細胞全抗體表達載體pAC-L-FcR,轉染Sf9細胞,利用桿狀病毒/昆蟲細胞系統(tǒng)實現(xiàn)全抗體的分泌型表達；將重鏈相同的的4株Fab抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)基因,分別克隆入哺乳動物全抗體表達載體HL51-14,轉染,293T細胞,利用雙質(zhì)粒/哺乳動物細胞表達系統(tǒng)實現(xiàn)全抗體的分泌型表達。通過直接免疫熒光檢測表達效果,收集上清進行純化,共獲得6株7種純度較高的IgG全抗體。利用ELISA對獲得的全抗體進行功能鑒定,結果表明7種人源IgG全抗體為特異性的抗乙肝表面抗原抗體,兩種表達系統(tǒng)表達的抗體滴度顯示293T細胞表達的抗體滴度更高。采用非競爭ELISA方法和BIAcore方法檢測親和力。采用非競爭ELISA固相法,Sf9細胞表達全抗的解離常數(shù)分別為1.06×10-8M、2.61×10-9M、2.50×10-10M,293T細胞表達全抗的解離常數(shù)分別為1.42×10-10M、1.61×10-10M、1.47×10-10M、3.57×10-10M,CHO-12-5的解離常數(shù)為1.93×10-10M。采用BIAcore法,Sf9細胞表達全抗的解離常數(shù)分別為5.80×10-8M、1.20×10-6M、5.47×10-9M,293T細胞表達全抗的解離常數(shù)分別為3.75×10-9M、9.53×10-9M、7.50×10-9M、7.75×10-9M。結果顯示IgG3具有較高的親和力,兩種表達系統(tǒng)未顯示出親和力的差異而兩種親和力檢測方法之間,較之ELISA方法的終點定量檢測,Biacore法無須標記并且可以實時監(jiān)測抗原抗體結合的速度、強度、特異性、穩(wěn)定性和結合量等詳細信息,說服力更好更保守。兩種親和力測定方法比較同一株抗體分別采用Sf9細胞穩(wěn)定表達和293T細胞瞬時表達的差異,發(fā)現(xiàn)KD值相差一個數(shù)量級,可能是兩種方法敏感性不同,有待于的進一步測定。本研究純化出IgG3人源抗體,如果按優(yōu)化比例和重組乙肝表面抗原組成抗原抗體復合物,或許會取得較好的治療效果,亟待進一步實驗結果的研究。
【學位授予單位】：中國疾病預防控制中心
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R392.1

【參考文獻】

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本文編號：2526221