【摘要】：目的:制備卡洛芬單克隆抗體,為研制卡洛芬的免疫學快速檢測奠定基礎(chǔ)。方法:通過活性酯法制備了以牛血清白蛋白(BSA)為載體的免疫抗原卡洛芬-BSA(Carprofen-BSA)和以卵清白蛋白(OVA)為載體的檢測抗原卡洛芬-OVA(Carprofen-OVA)。通過免疫BALB/c小鼠、雜交瘤技術(shù)獲得穩(wěn)定分泌卡洛芬單抗的細胞株51C3,并通過變異系數(shù)及添加回收率的測定初步建立了卡洛芬的ELISA檢測方法。結(jié)果:將該細胞株注射BALB/c小鼠制備腹水單抗。腹水純化后效價為1∶3.2×10~5,屬于IgG1型�？宸覇慰沟撵`敏度為0.32 ng/ml,IC50為0.882 ng/ml。單抗與布洛芬、酮洛芬、萘普生、非諾洛芬、吲哚洛芬、芬布芬的交叉反應率均小于0.04%。且豬肉樣品中卡洛芬的添加回收率在81.4%~104.4%之間,變異系數(shù)在16.3%~25.8%之間。結(jié)論:本研究成功制備了卡洛芬單克隆抗體,該單抗可以成功應用于卡洛芬的ELISA快速檢測,為研制卡洛芬的膠體金快速檢測奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

標準品，然后加入4g無水硫酸鈉，用玻璃棒攪勻加入15ml乙腈，于漩渦混合器上渦旋1min，4000r/min離心5min，取上清于蒸發(fā)瓶中，殘渣用15ml乙腈重復提取一次，渦旋1min，4000r/min離心5min，合并兩次上清液，加5ml異丙醇，在45℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸干，殘渣先加1ml乙腈，超聲溶解，然后加3ml乙腈飽和的正己烷，渦旋30s，轉(zhuǎn)移至10ml離心管中，4000r/min離心5min，取上清通過間接競爭ELISA測出OD值，計算抑制率，代入標準曲線回歸方程并根據(jù)以下公式計算添加回收率:添加回收率(%)=添加值(ng/g)/測定值(ng/g)×100%。圖1卡洛芬完全抗原紫外掃描圖譜Fig．1UltravioletspectrumofCarprofencompleteanti-gen熊艷華等卡洛芬單克隆抗體的制備第11期·1675·

fen，BSA和偶聯(lián)物通過紫外分光光度計在200nm～450nm之間掃描，結(jié)果見圖1。BSA在280nm處有一特征吸收峰，Carprofen在200nm、240nm和320nm左右有3個吸收峰，其中320nm處的吸收峰可以作為判定的特征吸收峰，從圖1A可以看出，Carprofen-BSA的圖譜在280nm，320nm處各有一吸收峰，表明Carprofen已經(jīng)偶聯(lián)在BSA上了。同理分析Carprofen-OVA的偶聯(lián)也是成功的(圖1B)。2.2免疫過程抗血清效價的監(jiān)控采用間接ELISA方法，，第1次免疫后，抗體的效價慢慢上升，約30d后抗體的效價維持不變，第2次免疫后，抗體的效價快速升高，結(jié)果見圖2。2.3抗體的效價根據(jù)1.2.7的方法可知卡洛芬-OVA的最適包被濃度為0.2mg/L，用該濃度的抗原包被檢測，純化后的單抗效價為1∶3.2×105結(jié)果見表1。按亞類鑒定試劑盒說明書中抗原介導的ELISA法進行鑒定測得卡洛芬51C3細胞分泌的單抗亞類為IgG1型。圖2免疫過程中抗體效價監(jiān)測圖Fig．2Antibodytitermonitoringchartinimmuneprocess2.4單抗的靈敏度及標準曲線用PBS將卡洛芬標準品按梯度稀釋成0、0.1、0.3、0.9、2.7、8.1ng/ml5個濃度，采用間接競爭ELISA的方法。以卡洛芬的濃度對數(shù)為X軸，以B/B0為Y軸擬合標準曲線，結(jié)果見圖3。線性回歸方程為y=－0.4569x+0.4751(Ｒ2=0.9902)。根據(jù)1.2.7中的方法，可以計算出卡洛芬單抗的靈敏度為0.32ng/ml，根據(jù)線性回歸方程計算得出單抗的IC50為0.882ng/ml。2.5交叉反應用卡洛芬的IC50除以其他非甾體類藥物的IC50得到交叉反應率，結(jié)果見表2。根據(jù)結(jié)果表明該卡洛芬單抗對表中其他非甾體類的交叉反圖3卡洛芬間接競爭ELISA的標準曲線Fig．3CarprofenindirectcompetitiveELISAcurve表251C3單抗與其他非甾體類藥物的交叉反應率Tab．2Cross-reactivityofmonocl
【作者單位】： 湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院;
【分類號】：R392-33

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本文編號：2526287