【摘要】：目的克隆粉塵螨變應(yīng)原Der f 2編碼基因,并構(gòu)建畢氏酵母表達(dá)體系,對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行圓二色分析。方法提取粉塵螨總RNA,根據(jù)GenBank中的序列設(shè)計(jì)并合成簡(jiǎn)并引物,PT-PCR擴(kuò)增Der f 2全長基因,與pGAPZα-A載體連接后轉(zhuǎn)化至E.coli Top10F',取陽性克隆并測(cè)序;將pGAPZα-A-Der f 2用BlnⅠ進(jìn)行線性化,電轉(zhuǎn)化至GS115感受態(tài)細(xì)胞,用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),采用SDS-PAGE驗(yàn)證表達(dá)產(chǎn)物,用His Trap HP親和柱純化重組蛋白Der f 2,進(jìn)行圓二色譜掃描分析。結(jié)果 PCR擴(kuò)增獲得Der f 2編碼基因,成功構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pGAPZα-A-Der f 2,SDS-PAGE驗(yàn)證表明該質(zhì)粒在GS115感受態(tài)細(xì)胞中正常表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物分子質(zhì)量單位為14.9ku,重組蛋白Der f 2純化后進(jìn)行圓二色譜數(shù)據(jù)分析,其二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋占41.2%,轉(zhuǎn)角占10.3%,β-折疊占26.8%,不規(guī)則卷曲占21.7%。結(jié)論塵螨變應(yīng)原Der f2在畢氏酵母中成功表達(dá),為該變應(yīng)原的進(jìn)一步研究及規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

鑒定ＭＤＬ２０００ＤＮＡｍａｒｋｅｒ１ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＤｅｒｆ２ｇｅｎｅＦｉｇ．１ＴｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｂｙａｇａｒｏｓｅｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（１．０％）２畢氏酵母表達(dá)質(zhì)粒ｐＧＡＰＺα－Ａ－Ｄｅｒｆ２構(gòu)建和酶切鑒定以ｐＧＡＰＺα－Ａ－Ｄｅｒｆ２為模板，ＰＣＲ擴(kuò)增目的基因，經(jīng)１％瓊脂糖凝膠電泳后回收產(chǎn)物并與ｐＧＡＰＺα－Ａ載體連接成為ｐＧＡＰＺα－Ａ－Ｄｅｒｆ２，經(jīng)ＸｈｏＩ和ＸｂａＩ雙酶切鑒定畢氏酵母表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功（圖２）。將篩選的陽性克隆送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序，結(jié)果與預(yù)期一致。３工程菌ｐＧＡＰＺα－Ａ－Ｄｅｒｆ２／ＧＳ１１５的構(gòu)建、篩癬表達(dá)及重組蛋白純化和濃縮用ＢｌｎⅠ對(duì)鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行線性化，然后電轉(zhuǎn)化畢赤酵母ＧＳ１１５感受態(tài)細(xì)胞，用菌落ＰＣＲ篩選陽性克攏分別挑�。硞�(gè)陽性酵母單菌落于含有１００ｍｇ／ＬＺｅｏｃｉｎ的ＹＰＤ液體培養(yǎng)基中，３００ｒ／ｍｉｎ、３０℃培養(yǎng)，每隔４８ｈ取１ｍｌ發(fā)酵菌液樣品１ｍｌ，離心取上清，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ鑒定表達(dá)產(chǎn)物約１４．９ｋｕ（圖３），與預(yù)期一致。取發(fā)酵菌液１．５Ｌ，１２０００ｒ／ｍｉｎ離心１ｈ，取上清，，調(diào)節(jié)ｐＨ至７．４。用ＨｉｓＴｒａｐＨＰ親和柱純化的重組蛋白，確定純化重組蛋白咪唑洗脫液最佳濃度為１００ｍｍｏｌ／Ｌ（圖４）。Ｍ１ＤＮＡ標(biāo)志物（ＤＬ２０００）Ｍ２ＤＮＡ標(biāo)志物（ＤＬ１５０００）１ＸｈｏⅠ和ＸｂａⅠ雙酶切圖２質(zhì)粒ｐＧＡＰＺα－Ａ－Ｄｅｒｆ２的ＸｈｏⅠ和

ｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅＸｈｏⅠａｎｄＸｂａⅠＭ蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)２４重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌表達(dá)產(chǎn)物圖３Ｄｅｒｆ２畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)物ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析ＭＰｒｏｔｅｉｎＭＷｍａｒｋｅｒ（Ｂｒｏａｄ）２－４Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｄｅｒｒｆ２ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎＦｉｇ．３ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓＤｅｒｆ２Ｍ蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)１ＨｉｓＴｒａｐＨＰ親和柱純化的重組蛋白圖４Ｄｅｒｆ２畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)物純化后ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析ＭＰｒｏｔｅｉｎＭＷｍａｒｋｅｒ（Ｂｒｏａｄ）１Ｄｅｒｒｆ２ｐｕｒｉｆｉｅｄｒｅｃｏｍｂｉ－ｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎＦｉｇ．４ＳＤＳ－ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｐｒｏｄｕｃｔｏｆＤｅｒｆ２·５４７·中國病原生物學(xué)雜志ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰａｔｈｏｇｅｎＢｉｏｌｏｇｙ２０１７年６月第１２卷第６期Ｊｕｎｅ２０１７，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．６
【作者單位】： 鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院;東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鹽城醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室;
【基金】：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.NSFC31272369,NSFC81001330,NSFC 30060166,NSFC31572319) 江蘇省衛(wèi)生廳招標(biāo)項(xiàng)目(No.Z200914) 鹽城市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(YK2014047)
【分類號(hào)】：R384.4

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本文編號(hào)：2524029