【摘要】：研究目的 脂肪組織不僅是儲(chǔ)能組織,脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,與糖尿病,高血壓,動(dòng)脈粥樣硬化,炎癥反應(yīng)密切相關(guān),促進(jìn)心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展。胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)具有類胰島素樣作用,是生長(zhǎng)因子促進(jìn)因子,影響多種細(xì)胞的增殖,生長(zhǎng)及分化。同樣,IGF-1調(diào)控脂肪細(xì)胞的行為,影響脂肪細(xì)胞的細(xì)胞周期,在脂肪細(xì)胞增殖中作為必須的因子調(diào)控細(xì)胞周期G1期至S期。黏著斑激酶(FAK)調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生物學(xué)行為,與其家族成員一起作為細(xì)胞多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的樞紐發(fā)揮重要作用。尤其是它們中的PYK2是調(diào)節(jié)細(xì)胞活性的中心。IGF-Ⅰ能加快細(xì)胞移動(dòng)、FAK磷酸化,并能激活PYK2調(diào)節(jié)細(xì)胞間的黏附。Gax基因具有抑制細(xì)胞遷移,增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用。Gax可干預(yù)細(xì)胞的周期,使有絲分裂的細(xì)胞停止于G1期,這與IGF-1作用相反。但目前關(guān)于Gax能否抑制IGF-1干預(yù)的脂肪細(xì)胞通道蛋白FAK, PYK2尚未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在對(duì)其進(jìn)行闡述。 研究方法 1.將目的基因GAX從原始質(zhì)粒上切下,與腺病毒載體重組,獲得重組腺病毒質(zhì)粒,鑒定正確后,純化擴(kuò)增腺病毒。 2.細(xì)胞培養(yǎng)用3-4代3T3-L1前脂肪細(xì)胞培養(yǎng),直到接觸抑制后2天后用地塞米松,IBMX及胰島素等培養(yǎng)脂肪細(xì)胞,11天左右脂肪細(xì)胞出現(xiàn)大量脂滴。用油紅O染色鑒定90%以上脂肪細(xì)胞出現(xiàn)脂滴,符合實(shí)驗(yàn)要求。 3.實(shí)驗(yàn)分組 (1)按是否含Gax病毒分組：用含Gax的腺病毒轉(zhuǎn)染脂肪細(xì)胞,分為空白對(duì)照組,Ad-GFP組,Ad-Gax組,干預(yù)時(shí)間為48h。 (2)按IGF-1的干預(yù)及Gax腺病毒的轉(zhuǎn)染分組：分為空白對(duì)照組,Ad-GFP組,Ad-Gax組,IGF-1+Ad-Gax組,Ad-GFP+IGF-1組,各組干預(yù)時(shí)間均為48h。 4.蛋白免疫印記技術(shù)按是否含Gax病毒分組,觀察48h后脂肪細(xì)胞Gax的蛋白表達(dá)情況。按IGF-1和Gax轉(zhuǎn)染分組,觀察各組48h后脂肪細(xì)胞FAK, PYK2的蛋白表達(dá)情況。 5.實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)檢測(cè)IGF-1及Gax干預(yù)48h后脂肪細(xì)胞FAK, PYK2的mRNA相對(duì)表達(dá)。 結(jié)果 1.經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定證實(shí)Gax基因成功插入到目的載體上,獲得重組腺病毒。 2.脂肪細(xì)胞鑒定：用第3-4代3T3-L1前體脂肪細(xì)胞接觸抑制2天后誘導(dǎo)分化,第5天左右出現(xiàn)脂滴,第11天左右90%脂肪細(xì)胞出現(xiàn)脂滴,經(jīng)油紅O染色證實(shí)為脂肪細(xì)胞,用于實(shí)驗(yàn)。 3.病毒轉(zhuǎn)染：重組Gax腺病毒轉(zhuǎn)染脂肪細(xì)胞,48h后行倒置熒光顯微鏡觀察,90%脂肪細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光。 4.蛋白表達(dá)：病毒轉(zhuǎn)染脂肪細(xì)胞48h后,Ad-Gax組與空白對(duì)照組,Ad-GFP組相比較,Gax蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(p0.01),Ad-GFP與空白對(duì)照組比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。IGF-1及病毒干預(yù)脂肪細(xì)胞48h后,Ad-GFP+IGF-1組FAK, PYK2較空白對(duì)照組,Ad-GFP組,Ad-Gax組,Ad-Gax+IGF-1組比較蛋白表達(dá)水平顯著增加(p0.01), Ad-Gax組與Ad-Gax+IGF-1組FAK, PYK2較空白對(duì)照組,Ad-GFP組,Ad-GFP+IGF-1組比較蛋白表達(dá)水平顯著減少(p0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ad-GFP組較空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。 5. mRNA表達(dá)：IGF-1及腺病毒干預(yù)脂肪細(xì)胞48h后,Ad-GFP+IGF-1組FAK, PYK2的mnRNA相對(duì)表達(dá)較空白對(duì)照組,Ad-GFP組, Ad-Gax組,Ad-Gax+IGF-1組顯著增加(p0.01),Ad-Gax組與Ad-Gax+IGF-1組FAK, PYK2的mRNA相對(duì)表達(dá)較空白對(duì)照組,Ad-GFP組,Ad-GFP+IGF-1組比較顯著減少(p0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ad-GFP組較空白對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。 結(jié)論 1.大鼠Gax基因能有效轉(zhuǎn)染脂肪細(xì)胞,并且在脂肪細(xì)胞中表達(dá)。 2.Gax能有效抑制IGF-1對(duì)脂肪細(xì)胞的干預(yù)作用。 3.IGF-1能激活FAK, PYK2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路轉(zhuǎn)導(dǎo),刺激FAK, PYK2的mRNA及蛋白表達(dá),而Gax能有效對(duì)抗IGF-1的刺激作用,抑制FAK, PYK2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R363

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本文編號(hào)：2524018