【摘要】：目的:表達(dá)生殖支原體(Mycoplasma genitalium, Mg)MG427重組蛋白, 并研究其是否具有過氧化物酶活性,以進(jìn)一步探索Mg在宿主內(nèi)持續(xù)感染的可能機(jī)制。 方法:通過登錄GenBank獲取Mg的mg427基因序列,用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物,以Mg標(biāo)準(zhǔn)株G37 DNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增mg427基因;經(jīng)雙酶切后將mg427克隆入原核表達(dá)載體pGEX-6p-1以構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6p-1/mg427;經(jīng)測序鑒定后,定點誘導(dǎo)該基因中第289～291位核苷酸TGA密碼子突變?yōu)門GG;將突變后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coli BL21,并用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白MG427,SDS-PAGE和Western blotting分析和鑒定表達(dá)結(jié)果,GST親和層析柱純化重組蛋白,采用PreScission Protease將重組蛋白GST標(biāo)簽切除后經(jīng)Millipore Amicon Ultra-4離心超濾濃縮,用BCA法測定表達(dá)的重組蛋白濃度;將純化的MG427蛋白進(jìn)行氧化鐵二甲酚橙實驗(FOX)、DTT氧化實驗以探討其酶活性。 結(jié)果:PCR擴(kuò)增出約426 bp的目的基因;構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、雙酶切和測序鑒定其中插入的目的基因序列,經(jīng)BLAST比對與GenBank上登錄的Mg-G37的mg427基因序列完全一致。通過PCR介導(dǎo)的定點突變,mg427中的TGA被成功突變?yōu)門GG。經(jīng)SDS-PAGE分析,在IPTG誘導(dǎo)下,在表達(dá)菌中表達(dá)出相對分子量(Mr)約為41.1 KDa的重組目的蛋白,該目的蛋白在菌體細(xì)胞內(nèi)主要以可溶性形式存在。用GST親和層析柱成功純化出該重組蛋白,Westernblotting結(jié)果表明表達(dá)的重組蛋白為GST融合蛋白。采用PreScission Protease成功將重組蛋白(rMG427)上GST標(biāo)簽切除。FOX實驗的結(jié)果表明:MG427具有過氧化物酶活性,能在一定程度上降解H_2O_2,且不同濃度的MG427降解H_2O_2的速度不同;DTT氧化實驗結(jié)果表明MG427蛋白中含有半胱氨酸,可能通過形成二硫鍵參與過氧化物代謝。 結(jié)論: 1、成功構(gòu)建了pGEX-6p-1/MG427的原核表達(dá)載體,并在E.coli中表達(dá)出Mr約為41.1 KDa的可溶性重組蛋白; 2、MG427具有過氧化氫酶活性,其半胱氨酸殘基可能參與過氧化物代謝;
【圖文】：

1 瓊脂糖電泳分析 mg427 PCR 擴(kuò)增結(jié)果1 Amplification of mg427 gene of M. genirker ; 2-3 : PCR product of mg427gene；427 重組質(zhì)粒的鑒定X-6p-1/MG427 質(zhì)粒為模板行 PCR 經(jīng) BamHⅠ和 NotⅠ雙酶切，結(jié)果出現(xiàn)了兩個片段，大片段接近 5 0，初步證明 mg427 目的基因成功地生工進(jìn)行 DNA 序列測定，，驗證插的 Mg G37 的 mg427 序列進(jìn)行 blast

重組質(zhì)粒 pGEX-6p-1/MG427 的酶切ication of recombinant plasmid pGEX-6igested by BamHⅠand NotⅠ.； 2: pbp DNA Marker; 4: PCR product of p點突變技術(shù)，將mg427中289~291位核變后 PCR 結(jié)果顯示約 426bp 處有1 2 3 4 5
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R346

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2524089