【摘要】：目的：探討IL-17體外刺激小鼠星形膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)某些炎性因子、趨化因子的生成和相關(guān)調(diào)控蛋白的表達以及體外、體內(nèi)（EAE小鼠）微小RNA（microRNA，miRNA）表達譜的變化。方法：體外培養(yǎng)的C57BL/6小鼠原代星形膠質(zhì)細胞，用IL-17刺激（50ng/ml）后3h、6h、12h、24h和48h，行real-time PCR和ELISA方法檢查小鼠星形膠質(zhì)細胞合成白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）及巨噬細胞炎癥蛋白-2（macrophageinflammatory protein-2，MIP-2）、單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotacticprotein-1，MCP-1)和MCP-5的變化；同時用Western blot檢查IL-17刺激星形膠質(zhì)細胞后，上述各時間點A20（又稱tumor necrosis factor α inducible protein3，TNFAIP3）及磷酸化的NF-B p65亞基（p-NF-B/p65）蛋白的表達水平。此外，用miRNA芯片篩查IL-17刺激原代星形膠質(zhì)細胞后3h、6h及EAE模型小鼠發(fā)病14d、20d時腦組織中miRNA表達譜的變化；并用Western blot和熒光素酶報告基因技術(shù)確證能調(diào)控A20表達的miRNAs。結(jié)果：（1）IL-17刺激星形膠質(zhì)細胞后6h，其IL-6、TNF-α和MIP-2、MCP-1/5的mRNA及蛋白表達水平均顯著升高，且蛋白表達在刺激后12h達到峰值；（2）IL-17刺激星形膠質(zhì)細胞后6h，A20的蛋白表達顯著下調(diào)，但此時p-NF-B/p65的表達水平則處于高峰，與前述炎性因子及趨化因子的表達時相基本一致；（3）體內(nèi)外的miRNA芯片分析表明，用IL-17刺激星形膠質(zhì)細胞后3h和6h，高于對照組1.5倍以上的miRNAs共有98個，低于對照組0.5倍以下的miRNAs共有62個；而在抗原誘導(dǎo)的EAE模型小鼠（14d和20d）腦組織中，高于對照組1.5倍以上的miRNAs共有90個，而低于對照組0.5倍以下的miRNAs共有42個；另體內(nèi)外共同上調(diào)的miRNAs為36個；（4）篩選出的與A203'-UTR能夠互補配對，且上調(diào)的miRNAs（即miR-323-5p、miR-763、miR-141、miR-139-5p和miR-873）轉(zhuǎn)染至星形膠質(zhì)細胞后48h，結(jié)果顯示，miR-323-5p、miR-763和miR-873能明顯抑制A20的表達，并能降低野生型重組A20（pGL3-Promoter/WTA20）3'-UTR熒光素酶的活性，其中以miR-873的作用最為顯著。結(jié)論： IL-17刺激小鼠原代星形膠質(zhì)細胞后能誘導(dǎo)IL-6、TNF-α和MIP-2、MCP-1/5的合成與分泌，同時伴有A20的表達下調(diào)和p-NF-B/p65的表達增加；體外用IL-17刺激星形膠質(zhì)細胞（3h、6h）和體內(nèi)取EAE小鼠（14d、20d）腦組織共同篩出的miR-323-5p、miR-763和miR-873均能顯著抑制A20的蛋白表達，尤以miR-873的作用較為明顯。 目的：體外探討miR-873調(diào)控IL-17刺激小鼠原代星形膠質(zhì)細胞后產(chǎn)生某些炎性因子和趨化因子的作用及機制。方法：體外培養(yǎng)的C57BL/6小鼠原代星形膠質(zhì)細胞用miR-873或miR-873的長效抑制劑（LNA-anti-miR-873）轉(zhuǎn)染后48h，再行IL-17（50ng/ml）刺激6h，用real-time PCR和ELISA方法檢查其對IL-17誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生IL-6、TNF-α與MIP-2、MCP-1/5的影響；同時，用Westernblot檢查miR-873和LNA-anti-miR-873轉(zhuǎn)染后的細胞，其A20及p-NF-B/p65蛋白的表達水平。此外，用miR-873種子區(qū)突變（Mut-miR-873）和與種子區(qū)互補結(jié)合的A20基因3'-UTR突變（pGL3-Promoter/Mut A20）的熒光素酶報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細胞，測定其熒光素酶的活性，以鑒定A20為miR-873靶向調(diào)控的目標(biāo)蛋白。另合成發(fā)夾狀的A20小干擾RNA（A20shRNA）并轉(zhuǎn)染至星形膠質(zhì)細胞，在沉默A20基因的表達后再檢查其對IL-17誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生上述炎性和趨化因子及p-NF-B/p65表達的影響；再者，用PDTC（NF-B活性抑制劑）處理星形膠質(zhì)細胞后2h，再用IL-17刺激6h，觀察其對前述炎性因子與趨化因子生成的抑制作用。結(jié)果：（1）miR-873轉(zhuǎn)染至星形膠質(zhì)細胞后，，IL-6、TNF-α和MIP-2、MCP-1/5的mRNA及蛋白水平均明顯升高；而轉(zhuǎn)染了LNA-anti-miR-873后，上述炎性因子與趨化因子的mRNA和蛋白水平均顯著降低。同時，miR-873轉(zhuǎn)染組A20的表達顯著下調(diào)，而p-NF-B/p65的表達水平則明顯升高；（2）野生型miR-873（WT-miR-873）和重組載體pGL3-Promoter/WTA20共轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細胞后，能顯著降低pGL3-Promoter/WT A203'-UTR熒光素酶的活性，而Mut-miR-873轉(zhuǎn)染細胞后并未影響A203'-UTR的熒光素酶活性；另WT-miR-873或Mut-miR-873與pGL3-Promoter/Mut A20共轉(zhuǎn)染細胞后， pGL3-Promoter/Mut A203'-UTR熒光素酶的活性均未見明顯改變；（3）A20shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細胞后，其前述炎性因子與趨化因子的分泌量均明顯升高，且p-NF-B/p65的表達亦顯著增強。除此之外，用PDTC抑制NF-B活化后，星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生上述炎癥和趨化因子的水平也明顯下調(diào)。結(jié)論：miR-873能夠通過影響A20的表達和NF-B的活化調(diào)控由IL-17刺激星形膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的IL-6、TNF-α、MIP-2和MCP-1/5的生成。 目的：探討miR-873體內(nèi)調(diào)控小鼠EAE炎性病變的效應(yīng)。方法：使用抗原MOG35-55復(fù)制C57BL/6小鼠EAE模型，行real-time PCR檢查EAE小鼠病變過程中腦組織的miR-873、IL-17、IL-6、TNF-α及MIP-2、MCP-1/5的mRNA豐度，ELISA方法測定血清中上述炎性因子和趨化因子的分泌水平，同時用Westernblot檢查小鼠腦組織中A20和p-NF-B/p65蛋白的表達變化。此外，構(gòu)建miR-873過表達（LV-miR-873）和表達抑制（LV-sponge）的慢病毒表達載體，并經(jīng)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，用real-time PCR和ELISA法檢查miR-873對EAE小鼠產(chǎn)生前述炎性因子和趨化因子的影響；并用Western blot和免疫組化的方法檢查給予了LV-miR-873或LV-sponge的EAE小鼠，其腦組織和脊髓組織中A20和p-NF-B/p65表達的變化。另用HE和LFB染色，光鏡下觀察LV-miR-873和LV-sponge感染后的EAE小鼠，其脊髓中炎癥細胞浸潤和髓鞘損傷的程度；同時用電鏡觀察不同處理后的EAE小鼠髓鞘超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果：（1）抗原MOG35-55復(fù)制出小鼠EAE模型后，隨著發(fā)病時間的延長，miR-873的水平逐漸升高，且前述炎性因子和趨化因子的表達水平亦明顯上升，抗原給予20d時這些因子仍舊處于較高水平；與此同時，A20在EAE小鼠腦組織中的表達明顯下降，而NF-B活化的水平（即p-NF-B/p65的表達）則顯著增強。（2）LV-miR-873感染后的EAE小鼠，其IL-6、TNF-α及MIP-2、MCP-1/5的含量均明顯高于LV-ctrl感染的EAE小鼠，而LV-sponge處理的EAE小鼠，這些炎性因子和趨化因子的分泌水平均顯著減少；此外，LV-miR-873感染后的EAE小鼠，其腦和脊髓組織中A20的蛋白表達均明顯降低，但p-NF-B/p65的表達水平則明顯升高。（3）LV-miR-873感染后的EAE小鼠，其臨床癥狀的發(fā)生提前并加重，HE染色的結(jié)果顯示，LV-miR-873感染后的EAE小鼠，其脊髓部位有大量的炎性細胞浸潤，而LV-sponge感染的小鼠，其炎性細胞浸潤的程度則顯著減輕；另LFB染色證實，LV-miR-873感染后的EAE小鼠髓鞘損傷嚴重，而LV-sponge感染后的EAE小鼠，其髓鞘損傷則明顯減輕；電鏡下，LV-miR-873感染后的EAE小鼠，其髓鞘出現(xiàn)斷裂和崩解，而LV-sponge感染后的EAE小鼠，其髓鞘僅呈現(xiàn)輕微的松散狀態(tài)。結(jié)論：小鼠EAE模型發(fā)病后，其腦組織中的miR-873、IL-17、IL-6、TNF-α及MIP-2、MCP-1/5因子以及p-NF-B/p65的表達均呈顯著上調(diào)，但A20的表達則明顯下調(diào)；另體內(nèi)過表達miR-873能促進EAE小鼠前述炎癥和趨化因子及p-NF-B/p65的生成，但A20蛋白的表達則明顯下調(diào)；除此之外，過表達miR-873后，EAE小鼠脊髓的炎性細胞浸潤和髓鞘損傷明顯加重。但沉默miR-873后，上述蛋白和組織病變均呈現(xiàn)出與過表達miR-873相反的結(jié)果。由此可見，miR-873可能是調(diào)控小鼠EAE炎性病變的關(guān)鍵分子。
【圖文】：

圖 1 體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞形態(tài) 普通倒置顯微鏡下的細胞形態(tài)（A ×100；B ×400）；抗 GFAP 免疫細胞化學(xué)染色，GFAP 的表達定位于胞漿，呈棕黃色（C ×200）；抗 GFAP 免疫熒光染色與 DAPI 核染（D，E，F(xiàn) ×200）。IL-17 刺激星形膠質(zhì)細胞后不同時間及不同劑量時，炎癥因子（IL-6、TNF-α）和趨化因子（MIP-2、MCP-1/5 ）分泌水平的改變IL-17 刺激星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生上述炎性因子和趨化因子時間曲線的確定IL-17 是 Th17 產(chǎn)生的標(biāo)志性的細胞因子，同時作為促炎的細胞因子，可上些炎癥基因的表達[25]。為了研究 IL-17 對星形膠質(zhì)細胞產(chǎn)生某些炎性因子與因子的影響，我們體外給予培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞以 100 ng /ml 的 IL-17 刺激，不同時間（3h、6h、12h、24h 和 48h）細胞的總 RNA 和細胞上清，檢查炎子 IL-6、TNF-α 及趨化因子 MIP-2、MCP-1/5 的 mRNA 豐度與蛋白的分泌。如圖 2A 所示，與 DMEM 組相比，炎性因子 IL-6 和 TNF-α 的 mRNA 豐度

圖..月八舊...r，卜口...咐.目巨
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Michael Namaka;Sabina Kapoor;Leann Simms;Christine Leong;Amy Grossberndt;Michael Prouta;Emma Frost;Farid Esfahani;Andrew Gomori;Michael R. Mulvey;;Molecular mimicry and multiple sclerosis[J];Neural Regeneration Research;2011年17期

2 黃柏勝;劉發(fā)益;曹莉;賀芳;趙彥;鄔力祥;;星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)方法的改進[J];實用預(yù)防醫(yī)學(xué);2007年04期

本文編號：2523681