【摘要】：Toll樣受體（TLRs）信號(hào)通路誘導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)是宿主抵抗沙門氏菌感染的第一道防線。沙門氏菌感染雞后，正常狀態(tài)下，雞體內(nèi)的TLRs信號(hào)傳遞會(huì)迅速激活，但是抗病雞抵抗沙門氏菌和感病雞不能抵抗沙門氏菌的確切機(jī)制目前并不清楚。本文首先在細(xì)胞水平上研究LPS刺激和腸炎沙門氏菌（SE）感染雞細(xì)胞后TLRs家族基因的表達(dá)情況，然后在活體水平用SE對(duì)SPF雞攻毒，研究參與防御SE的幾個(gè)重要的TLRs基因的表達(dá)情況以及可能存在的TLRs基因調(diào)控和被調(diào)控的分子機(jī)制。全文共包括3個(gè)試驗(yàn)： 試驗(yàn)一：LPS刺激/沙門氏菌感染雞單個(gè)核細(xì)胞中TLRs家族基因的表達(dá)變化規(guī)律。從20只30日齡SPF中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），設(shè)計(jì)LPS刺激、腸炎沙門氏菌感染誘導(dǎo)和對(duì)照組三個(gè)處理，研究誘導(dǎo)后1h、6h和24h不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中9個(gè)TLRs基因的表達(dá)變化，并用1×10~9～1×10~4CFU10倍劑量梯度稀釋的SE感染雞PBMCs6h，進(jìn)一步驗(yàn)證不同劑量SE感染誘導(dǎo)對(duì)參與防御SE的三個(gè)重要的TLRs基因—TLR4、TLR2-1和TLR21表達(dá)的影響。結(jié)果表明：（1）LPS刺激和沙門氏菌感染均能上調(diào)7個(gè)TLRs基因的表達(dá)，包括TLR4、TLR21和TLR2-1等重要識(shí)別受體基因。（2）誘導(dǎo)后6h，LPS處理組中TLR4和TLR2基因的表達(dá)顯著上調(diào)（P 0.05），表達(dá)量為對(duì)照組的2倍以上。而沙門氏菌感染組TLR4的表達(dá)與對(duì)照組相比顯著下調(diào)（P 0.05），TLR21和TLR2的表達(dá)量則沒有顯著變化（P0.05）。（3）誘導(dǎo)后24h，，沙門氏菌感染組TLR21和TLR1-2上調(diào)表達(dá)的倍數(shù)顯著高于LPS處理組（P 0.05）；而TLR4、TLR2(TLR2-1和TLR2-2)和TLR1-1等基因在LPS處理組上調(diào)程度顯著高于沙門氏菌感染組（P 0.05）。（4）不同劑量的SE感染細(xì)胞后6h，TLR4、TLR21和TLR2-1的表達(dá)或顯著下調(diào)（P 0.05）或表達(dá)差異不顯著（P0.05）（1×10~9CFU的SE感染時(shí)TLR2-1的表達(dá)量除外），SE的感染劑量會(huì)影響表達(dá)下調(diào)的程度。感染劑量為0～1×106CFU時(shí)，增加沙門氏菌的劑量，TLRs基因表達(dá)抑制作用增強(qiáng)；而感染劑量為1×10~6～1×10~9CFU時(shí)，隨SE感染劑量的增加，TLRs基因表達(dá)抑制作用減弱。 試驗(yàn)二：抗病組和感病組雞中TLRs、炎癥因子及TLRs負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)差異。為了研究TLRs的表達(dá)與雞對(duì)沙門氏菌的抗、感病機(jī)制的關(guān)系，用8.7×10~8CFU的SE對(duì)20只30日齡的SPF雞進(jìn)行攻毒，攻毒后5日內(nèi)死亡的雞定為感病組，存活了15日的雞定為抗病組，兩組雞各6只，比較攻毒后0h、8h、16h、24h、3d、12d的載菌量及基因表達(dá)的差異。結(jié)果表明：（1）16h感病組血液中腸炎沙門氏菌的載菌量為1.1×107CFU，顯著高于抗病組（P 0.05）。（2）16h抗病組雞的體溫42.6℃顯著高于攻毒前0h的體溫41.9℃（P 0.05），而感病雞體溫的增加沒有達(dá)到顯著（P0.05）；3d時(shí)感病雞的體溫41.1℃顯著低于抗病雞的體溫42.3℃（P 0.05）。（3）感病組雞體重自16h持續(xù)下降，而抗病組16h后體重增加；在3d時(shí)感病組體重212.7g顯著低于抗病組體重252.9g（P 0.05）。（4）感病雞白細(xì)胞中TLR4、TLR2-1和TLR21的表達(dá)量顯著低于抗病組（P 0.05）。（5）IFN-β和促炎癥因子IL-6的基因表達(dá)量在抗病雞中顯著高于感病組（P0.05）。（6）負(fù)調(diào)控基因ZNF493和TOLLIP僅在感病雞中顯著上調(diào)表達(dá)（P 0.05）。以上結(jié)果表明：TLRs基因的表達(dá)受到抑制導(dǎo)致炎癥因子表達(dá)不足、載菌量增加、體重下降是感病組雞死亡的主要原因。 試驗(yàn)三：表觀遺傳修飾對(duì)TLRs基因的表達(dá)調(diào)控。為深入研究感病雞中SE感染后16h時(shí)TLRs的表達(dá)抑制是否與ZNF493依賴的表觀調(diào)控相關(guān)，在細(xì)胞水平研究了甲基化酶和去乙�；敢种苿⿲�(duì)雞單個(gè)核細(xì)胞TLRs的表達(dá)變化；并用重亞硫酸鹽修飾后測(cè)序PCR（BSP）方法比較了感病組和抗病組雞中TLR4、TLR21和TLR2-1基因啟動(dòng)子區(qū)域以及外顯子區(qū)域的CpG島的甲基化水平。結(jié)果表明：（1）在沙門氏菌感染的外周血單個(gè)核細(xì)胞中，甲基化酶抑制劑5-Aza-dc處理均可以顯著增加TLR4的表達(dá)（P 0.05），5-Aza-dc和TrichostatinA都可以顯著上調(diào)TLR21和TLR2-1的表達(dá)（P 0.05），但兩者沒有協(xié)同效應(yīng)。（2）感病組雞TLR4和TLR21啟動(dòng)子區(qū)域、TLR2-1的外顯子CpG島區(qū)域的甲基化程度顯著高于抗病雞（P 0.05）。結(jié)果表明：TLR4、TLR21和TLR2-1的表達(dá)受甲基化調(diào)控，感病雞中TLR4、TLR21和TLR2-1的表達(dá)抑制可能由于過高的甲基化引起。 總體而言，本研究結(jié)果表明TLRs家族中TLR4、TLR21和TLR2-1是腸炎沙門氏菌感染的重要識(shí)別受體，雞白細(xì)胞中TLR4、TLR21和TLR2-1的表達(dá)被抑制是導(dǎo)致沙門氏菌易感性增加、雞死亡的主要原因，而ZNF493相關(guān)的表觀修飾促使TLRs表達(dá)被抑制。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2523871