【摘要】：目的：建立一種溫度敏感型干細(xì)胞系,研究其在亞低溫(33℃)和正常體溫(37℃)兩種環(huán)境下的增殖與分化特點(diǎn),同時(shí)利用BDNF的營(yíng)養(yǎng)和誘導(dǎo)作用增加移植干細(xì)胞向神經(jīng)元方向的分化比例,為腦外傷患者接受亞低溫治療期間實(shí)施干細(xì)胞原位移植打下基礎(chǔ)。 方法：采用原代細(xì)胞貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)人源性UCMSCs,流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行表面標(biāo)記蛋白鑒定,體外誘導(dǎo)其向神經(jīng)細(xì)胞分化。用含溫度敏感性猿猴病毒40大T抗原(tsSV40LT)的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染UCMSCs, PCR檢測(cè)外源基因的整合,繪制其在33℃和37℃培養(yǎng)條件下的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期,PCR-ELISA端粒酶檢測(cè)法檢測(cè)端粒酶活性,Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白---cyclin D1、CDK2和P16蛋白的表達(dá)；血清依賴實(shí)驗(yàn)及軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)該細(xì)胞系在兩種溫度下的致瘤潛能；利用腺病毒載體轉(zhuǎn)染BDNF進(jìn)入U(xiǎn)CMSCs, ELISA方法測(cè)定BDNF分泌時(shí)相,免疫熒光方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染與非轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)NSE和GFAP的比例；建立去胸腺小鼠顱腦液壓打擊模型進(jìn)行干細(xì)胞原位移植,腦組織標(biāo)本行增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)免疫組化及原位細(xì)胞凋亡檢測(cè),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物予以神經(jīng)功能缺陷評(píng)分。 結(jié)果：利用原代貼壁細(xì)胞培養(yǎng)法成功獲得UCMSCs,流式細(xì)胞結(jié)果符合UCMSCs特征,經(jīng)體外條件誘導(dǎo),UCMSCs可表達(dá)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白；PCR結(jié)果顯示tsSV40LT抗原的基因片段被成功整合入干細(xì)胞,端粒酶活性高,cyclin D1和CDK2高表達(dá),P16低表達(dá),并高表達(dá)nestin,不表達(dá)NSE和GFAP,同時(shí)該細(xì)胞系在33℃時(shí)增殖旺盛,可耐受極低的營(yíng)養(yǎng)條件,并可在軟瓊脂中形成小的細(xì)胞克�。辉�37℃條件下細(xì)胞增殖緩慢甚至停滯,端粒酶活性低,cyclin D1和CDK2的表達(dá)強(qiáng)度明顯低于33℃條件,P16則相反,與此同時(shí)nestin表達(dá)強(qiáng)度明顯下降,NSE和GFAP表達(dá)水平上升,低營(yíng)養(yǎng)耐受力下降,無(wú)細(xì)胞克隆形成；BDNF的表達(dá)水平于病毒轉(zhuǎn)染后第72h達(dá)到高峰,此期干細(xì)胞NSE陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯增多(P0.05),相反GFAP陽(yáng)性細(xì)胞比例下降；動(dòng)物體內(nèi)結(jié)果顯示,亞低溫治療期間的腦組織高表達(dá)PCNA,凋亡細(xì)胞少見(jiàn)；常溫組腦組織則低表達(dá)PCNA,創(chuàng)傷灶周邊見(jiàn)較多凋亡細(xì)胞存在。 結(jié)論： (1)借助tsSV40LT抗原建立的溫度敏感型UCMSCs細(xì)胞系,在細(xì)胞增殖和1分化方面具有顯著的溫度可調(diào)控性特征,即在其適宜溫度下(33℃)增殖能力旺盛,并維持在前體細(xì)胞水平,極少產(chǎn)生細(xì)胞分化；當(dāng)其處于37℃環(huán)境中時(shí)則停止增長(zhǎng),轉(zhuǎn)而分化為神經(jīng)細(xì)胞； (2)溫度敏感型UCMSCs細(xì)胞系在其適宜溫度下存在一定的致瘤性(對(duì)低營(yíng)養(yǎng)環(huán)境的高耐受力和半固體介質(zhì)中的強(qiáng)克隆形成能力),但當(dāng)其處于非適宜溫度(37℃)下則幾乎完全失去了增殖能力,也不再具有致瘤性。其潛在致瘤性可以通過(guò)改變溫度得到有效控制； (3)常溫條件下在腦創(chuàng)傷及其近緣部位移植的干細(xì)胞,絕大部分因?yàn)椴荒褪軇?chuàng)傷灶半損傷帶的低營(yíng)養(yǎng)、高毒素環(huán)境而死亡；但在亞低溫環(huán)境中,在創(chuàng)傷灶半損傷帶移植溫度敏感型的UCMSCs,可見(jiàn)存活的細(xì)胞顯著增多,同時(shí)凋亡減少,動(dòng)物神經(jīng)功能得到有效恢復(fù)； (4)通過(guò)對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行BDNF基因轉(zhuǎn)染可增加干細(xì)胞向神經(jīng)元而非神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化比例,結(jié)合其自身的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用,進(jìn)一步提高干細(xì)胞恢復(fù)創(chuàng)傷后神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能的潛能。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R329

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 段小紅!710032西安,吳軍正!710032西安,毛勇!710032西安,李峰,楊彤元!710032西安;SV40誘導(dǎo)髁突軟骨細(xì)胞永生化的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華口腔醫(yī)學(xué)雜志;2001年01期

2 鄧志鋒;汪泱;鄧麗影;賴賢良;宋書欣;徐麗君;涂偉;郭華;湯愛(ài)萍;;自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病(附五例報(bào)告)[J];實(shí)用臨床醫(yī)學(xué);2007年06期

3 張賽;亞低溫腦保護(hù)的研究進(jìn)展[J];中國(guó)綜合臨床;2003年04期

，

本文編號(hào)：2523308