【摘要】：目的：建立一種溫度敏感型干細胞系,研究其在亞低溫(33℃)和正常體溫(37℃)兩種環(huán)境下的增殖與分化特點,同時利用BDNF的營養(yǎng)和誘導作用增加移植干細胞向神經(jīng)元方向的分化比例,為腦外傷患者接受亞低溫治療期間實施干細胞原位移植打下基礎。 方法：采用原代細胞貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)人源性UCMSCs,流式細胞術進行表面標記蛋白鑒定,體外誘導其向神經(jīng)細胞分化。用含溫度敏感性猿猴病毒40大T抗原(tsSV40LT)的表達質(zhì)粒轉染UCMSCs, PCR檢測外源基因的整合,繪制其在33℃和37℃培養(yǎng)條件下的細胞生長曲線；流式細胞術檢測細胞周期,PCR-ELISA端粒酶檢測法檢測端粒酶活性,Western Blot法檢測細胞周期調(diào)控蛋白---cyclin D1、CDK2和P16蛋白的表達；血清依賴實驗及軟瓊脂克隆形成實驗檢測該細胞系在兩種溫度下的致瘤潛能；利用腺病毒載體轉染BDNF進入UCMSCs, ELISA方法測定BDNF分泌時相,免疫熒光方法檢測轉染與非轉染細胞表達NSE和GFAP的比例；建立去胸腺小鼠顱腦液壓打擊模型進行干細胞原位移植,腦組織標本行增殖細胞核抗原(PCNA)免疫組化及原位細胞凋亡檢測,實驗動物予以神經(jīng)功能缺陷評分。 結果：利用原代貼壁細胞培養(yǎng)法成功獲得UCMSCs,流式細胞結果符合UCMSCs特征,經(jīng)體外條件誘導,UCMSCs可表達神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞標記蛋白；PCR結果顯示tsSV40LT抗原的基因片段被成功整合入干細胞,端粒酶活性高,cyclin D1和CDK2高表達,P16低表達,并高表達nestin,不表達NSE和GFAP,同時該細胞系在33℃時增殖旺盛,可耐受極低的營養(yǎng)條件,并可在軟瓊脂中形成小的細胞克��；在37℃條件下細胞增殖緩慢甚至停滯,端粒酶活性低,cyclin D1和CDK2的表達強度明顯低于33℃條件,P16則相反,與此同時nestin表達強度明顯下降,NSE和GFAP表達水平上升,低營養(yǎng)耐受力下降,無細胞克隆形成；BDNF的表達水平于病毒轉染后第72h達到高峰,此期干細胞NSE陽性細胞比例明顯增多(P0.05),相反GFAP陽性細胞比例下降；動物體內(nèi)結果顯示,亞低溫治療期間的腦組織高表達PCNA,凋亡細胞少見；常溫組腦組織則低表達PCNA,創(chuàng)傷灶周邊見較多凋亡細胞存在。 結論： (1)借助tsSV40LT抗原建立的溫度敏感型UCMSCs細胞系,在細胞增殖和1分化方面具有顯著的溫度可調(diào)控性特征,即在其適宜溫度下(33℃)增殖能力旺盛,并維持在前體細胞水平,極少產(chǎn)生細胞分化；當其處于37℃環(huán)境中時則停止增長,轉而分化為神經(jīng)細胞； (2)溫度敏感型UCMSCs細胞系在其適宜溫度下存在一定的致瘤性(對低營養(yǎng)環(huán)境的高耐受力和半固體介質(zhì)中的強克隆形成能力),但當其處于非適宜溫度(37℃)下則幾乎完全失去了增殖能力,也不再具有致瘤性。其潛在致瘤性可以通過改變溫度得到有效控制； (3)常溫條件下在腦創(chuàng)傷及其近緣部位移植的干細胞,絕大部分因為不耐受創(chuàng)傷灶半損傷帶的低營養(yǎng)、高毒素環(huán)境而死亡；但在亞低溫環(huán)境中,在創(chuàng)傷灶半損傷帶移植溫度敏感型的UCMSCs,可見存活的細胞顯著增多,同時凋亡減少,動物神經(jīng)功能得到有效恢復； (4)通過對干細胞進行BDNF基因轉染可增加干細胞向神經(jīng)元而非神經(jīng)膠質(zhì)細胞的分化比例,結合其自身的神經(jīng)營養(yǎng)作用,進一步提高干細胞恢復創(chuàng)傷后神經(jīng)運動功能的潛能。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R329

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 段小紅!710032西安,吳軍正!710032西安,毛勇!710032西安,李峰,楊彤元!710032西安;SV40誘導髁突軟骨細胞永生化的實驗研究[J];中華口腔醫(yī)學雜志;2001年01期

2 鄧志鋒;汪泱;鄧麗影;賴賢良;宋書欣;徐麗君;涂偉;郭華;湯愛萍;;自體骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷性疾病(附五例報告)[J];實用臨床醫(yī)學;2007年06期

3 張賽;亞低溫腦保護的研究進展[J];中國綜合臨床;2003年04期

，

本文編號：2523308