發(fā)布時間：2019-08-01 15:17

【摘要】：背景與目的 自噬是細胞成份的自我降解過程，它是存在于真核細胞中一種普遍的生命現(xiàn)象。自噬可以實現(xiàn)細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，并且與多種疾病的發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)系。microRNAs是一類由DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，不翻譯成蛋白質(zhì)的小調(diào)控RNA。它通過與靶mRNA的序列互補，以降解靶mRNA或抑制其翻譯。近來研究表明microRNAs參與生物體的一系列生物過程，而且microRNAs在癌癥、神經(jīng)退行性疾病、感染、衰老、心臟病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。最近已有報道，microRNAs可以調(diào)控自噬過程中自噬相關(guān)蛋白的表達。本研究通過系列生物信息學方法，篩選對自噬過程有潛在調(diào)控作用的microRNAs，并通過相關(guān)生物學實驗進行驗證。同時利用回轉(zhuǎn)器模擬微重力效應(yīng)，探究神經(jīng)細胞自噬與微重力之間的關(guān)聯(lián)性。 方法 利用生物信息學方法預(yù)測出可能參與自噬調(diào)控的microRNAs。利用雷帕霉素分別誘導乳腺癌細胞MCF7、卵巢癌細胞SKOV-3 12h以使細胞產(chǎn)生自噬。microRNAs模擬物或microRNAs抑制劑轉(zhuǎn)染細胞，此時microRNAs過表達或低表達，然后觀察細胞中微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）的表達水平�；剞D(zhuǎn)模擬微重力的細胞學效應(yīng)，回轉(zhuǎn)條件下培養(yǎng)人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y 12h、24h，相同條件下靜止培養(yǎng)的細胞作為對照組。Western Blotting方法檢測LC3蛋白表達水平。熒光顯微鏡觀察綠色熒光標記的LC3（GFP-LC3）點狀聚集物變化。 結(jié)果 （1）建立自噬誘導的模型：雷帕霉素處理細胞12h以誘導自噬，雷帕霉素組中GFP-LC3點狀聚集物多于對照組分別體現(xiàn)在MCF7細胞（P 0.05）和SKOV-3細胞（P 0.001）中。MCF7細胞中雷帕霉素+氯化銨組GFP-LC3點狀聚集物顯然高于其余各組（P 0.01）。Western Blotting檢測MCF7細胞和SKOV-3細胞中LC3蛋白表達水平，與對照組相比，雷帕霉素組皆顯示LC-II表達升高。MCF7細胞中雷帕霉素+氯化銨組LC3-II表達增多更為顯著。 （2）篩選出與自噬相關(guān)的microRNAs為miR-142-5p，經(jīng)生物實驗驗證miR-142-5p對雷帕霉素誘導的MCF7細胞自噬中LC3表達無明顯影響； （3）篩選與卵巢癌細胞自噬有關(guān)的4個microRNAs中，其中一個microRNA在雷帕霉素誘導SKOV-3細胞情況下，瞬時轉(zhuǎn)染microRNAs模擬物或microRNAs抑制劑，Western Blotting結(jié)果中microRNAs模擬物可降低LC3蛋白的表達水平，反之，microRNAs抑制劑可使LC3蛋白表達水平升高。熒光顯微鏡下觀察到，microRNAs模擬物使細胞中GFP-LC3點狀聚集物減少，而microRNA抑制劑物卻增加了GFP-LC3點狀聚集物的聚集。而且其余3個microRNAs模擬物對SKOV-3細胞中LC3表達無顯著變化； （4）Western Blotting結(jié)果顯示SH-SY5Y細胞的LC3-II蛋白表達回轉(zhuǎn)組高于對照組回轉(zhuǎn)+氯化銨組顯著高于回轉(zhuǎn)組和對照組，熒光顯微鏡下觀察到GFP-LC3點狀聚集物隨之增多。結(jié)論 雷帕霉素可以誘導SKOV-3細胞和MCF7細胞產(chǎn)生自噬效應(yīng)，miR-142-5p對MCF7細胞的自噬無明顯作用。而篩選出的與卵巢癌細胞自噬有關(guān)的4個microRNAs中亦有一個microRNAs對SKOV-3細胞自噬有影響，其余3個microRNAs對SKOV-3細胞自噬無統(tǒng)計學意義。自噬相關(guān)microRNAs分子的篩選鑒定，可以促進自噬分子機制的認識。模擬微重力可誘導SH-SY5Y細胞中自噬體增多，故自噬對神經(jīng)細胞產(chǎn)生的影響可能為航天醫(yī)學的研究提供一個新的線索。
【圖文】：

圖 2.1 細胞自噬的三種主要形式（摘自：Bejarano et al. ProAm Thorac Soc, 2010）.1.3 自噬相關(guān)基因 Atg酵母是最早用于研究自噬的模式細胞，，也是自噬研究較為深入的細胞。目前至少7 個酵母自噬相關(guān)基因為我們所知，許多基因的相關(guān)功能也已被報道，而且大多數(shù)自關(guān)基因在果蠅、線蟲、哺乳動物等多種物種中具有保守性。起初這些基因被稱為 Aput，或 Cvt，現(xiàn)在統(tǒng)一命名為自噬相關(guān)基因 Atg（autophagy-related gene）[37]。自噬基克隆始于酵母，1997年日本科學家Yoshinori Ohsumi小組克隆出第一個酵母自噬基因名為 Atg 1[38]。伴隨著研究的發(fā)現(xiàn)，一些存在于酵母中的自噬相關(guān)基因的同源物亦哺乳動物中發(fā)現(xiàn)，并且已被分離成功鑒定。哺乳動物中自噬相關(guān)基因的命名與酵母，但由于自噬研究的歷史原因，一些基因在酵母和哺乳動物中有不同的命名。19美國科學家 Beth Levine 小組克隆出第一個哺乳動物自噬基因[39]，命名為 Beclin

圖 2.2 細胞自噬體的形成過程（摘自：Maiuri et al. Mol Cell Biol, 2007）表 2.1 自噬形成過程中所參與的關(guān)鍵蛋白（摘自：Mizushima et al. Cell, 2010）
【學位授予單位】：中北大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R346

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本文編號：2521827