【摘要】：蛋白質翻譯后修飾在生命體中具有十分重要的作用,它使蛋白質的結構更為復雜,功能更為完善,調節(jié)更為精細。這些修飾包括糖基化、N-末端乙�；�、磷酸化、C-末端酰胺化等等。其中N-末端乙�；亲钇毡榈墓矁r修飾之一。目前,我們對蛋白質的N-末端乙酰化修飾的認識主要來自真核生物,而在原核細胞中,N-末端乙�；揎棙O其罕見,相關研究更為稀少。 蛋白質的Nα-末端乙�；揎検怯蒒α-末端乙�；D移酶(Nα-terminal acetyltransferases, NATs)將乙酰輔酶A的乙�；�(CH3CO-,分子量約43Da)轉移到蛋白質N-末端的Alpha氨基上。蛋白質是否N-末端乙�；揎椫辽偃Q于兩個條件:是否有合適的Nα-末端乙�；D移酶(NAT),是否有合適的N-末端氨基酸序列。目前確知的原核生物NAT有三種:大腸桿菌的RimI、RimJ和RimL,它們分別負責大腸桿菌核糖體蛋白S18、S5和L12的N-末端乙�；揎�。關于N-末端氨基酸序列對N-末端乙酰化影響的研究主要集中于真核生物,并且不同于蛋白質N-糖基化修飾位點的氨基酸序列高度保守,我們還不能根據(jù)蛋白質N-末端的氨基酸序列來推測此蛋白是否可被N-末端乙�；揎�。 胸腺素α1(Thymosinα1,Tα1)是具有免疫刺激作用的物質,由28個氨基酸組成,分子量3108 Da,等電點4.2,其N-末端的Ser被乙�；揎�,其前體是胸腺素α原(ProTα)。Tα1具重要的免疫調節(jié)作用,在癌癥和感染性疾病方面有巨大應用價值,如化學合成的Tα1—“日達仙”已廣泛用于治療病毒性肝炎和腫瘤。但化學法合成Tα1成本高,采用基因工程方法生產(chǎn)重組N-末端乙�；疶α1,有望降低成本提高產(chǎn)量。 本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),在利用大腸桿菌表達胸腺素α原(ProTα)時,ProTα有部分乙�；揎棳F(xiàn)象[1]。Fang等[2]在大腸桿菌內表達Tα1-L12融合蛋白時發(fā)現(xiàn),Nα-末端乙�；D移酶RimJ是Tα1-L12乙�；闹饕揎椕�。為了進一步研究大腸桿菌對ProTαN-末端乙�；揎椀臋C理,我們敲除了大腸桿菌DH5α的rimI、rimJ和rimL三個基因,觀察ProTα在各缺陷菌中的乙�；�。本研究用Red重組的方法構建了rims基因的單敲除、雙敲除和三敲除菌株(單敲除菌株3株DH5αΔrimJ、DH5αΔrimL、DH5αΔrimI,雙敲除菌株3株DH5αΔrimJΔrimL、DH5αΔrimJΔrimI、DH5αΔrimLΔrimI和三敲除菌株1株DH5αΔrimJΔrimLΔrimI),在缺陷菌中表達ProTα蛋白,經(jīng)陰離子交換層析純化后,用RP-HPLC檢測相應ProTα的乙�；�。結果表明,只要敲除rimJ基因就能使ProTα的乙�；F(xiàn)象消失;單敲除rimL和rimI基因,以及全敲除此兩個基因對ProTα的乙�；綗o影響。這表明,在天然狀態(tài)下,RimJ也是ProTα的主要修飾酶。 過表達rims基因是否也能得出相同的結論呢?為了探討過量Rims蛋白對ProTα乙酰化的影響,本研究分別在大腸桿菌DH5α/pBV220-proTα和DH5αΔrimJΔrimLΔrimI/pBV220-proTα中過表達了rims基因,經(jīng)RP-HPLC檢測發(fā)現(xiàn),在野生菌DH5α和三缺陷菌株DH5αΔrimJΔrimLΔrimI中過表達rimL或rimJ都能使ProTα幾乎完全乙�；�,而過表達rimI卻抑制ProTα的乙�；�。為了進一步研究rimI基因的作用,本研究采用雙因素析因設計,考察了“是否過表達rimI”和“誘導時間”兩個因素對ProTα乙�；挠绊�。在ProTα的RP-HPLC圖上,對未乙�；鸵阴；暹M行面積積分,獨立重復三次實驗,用SAS統(tǒng)計軟件分析相應數(shù)據(jù)。結果表明,有無rimI的過表達、誘導時間的長短以及兩個因素之間的交叉效應均對ProTα的乙�；潭扔杏绊�,其F值分別為53.8、89.22及16.28,P值均小于0.0001;無論有無rimI過表達,與誘導6h前相比,乙�；腜roTα所占比例逐漸升高(P0.0001);在過表達rimI的菌株中,乙�；腜roTα在誘導12h后占37.4%,而在無rimI過表達的菌株中占64.3%;RimI對ProTα乙酰化的抑制作用從誘導6h后開始顯現(xiàn)(P=0.0007)。 本研究初步探討了N-末端氨基酸序列對大腸桿菌表達的ProTα乙�；潭鹊挠绊�。雖然,文獻報道在真核細胞中蛋白的N-末端第一位氨基酸是Ser和Ala時,此蛋白被乙�；母怕瘦^大,如果其后的氨基酸為Met、Gly和Thr時,大約95%的蛋白會被乙�；揎�;N-末端第二位氨基酸同樣影響蛋白質的N-末端乙酰化修飾,酵母中,蛋白質N-末端第一位氨基酸是Ser、Ala、Thr、Met時,如果第二位氨基酸是Glu/Asp會促進乙�；揎�,而Pro會抑制乙�；揎�。但是,此規(guī)律在不同的物種中有所變化,并且也只是統(tǒng)計學規(guī)律,并不能夠作為判斷蛋白質是否被N-末端乙�；揎椀臉藴�。為了研究ProTα的第一和第二位氨基酸對其在大腸桿菌中的乙�；揎椀挠绊�,根據(jù)文獻報道,本研究構建了10種N-末端氨基酸突變的ProTα,其中第一位Ser突變株4種(ProTαMet1、ProTαThr1、ProTαAla1和ProTαGly1),第二位Asp突變株6種(ProTαVal2、ProTαCys2、ProTαGlu2、ProTαAla2、ProTαPro2和ProTαGly2)。將陰離子交換層析純化的各ProTα突變體用MALDI-TOF MS檢測其分子量,由此分析各突變體的乙�；闆r。結果發(fā)現(xiàn),與天然ProTα相比,將ProTα第一位絲氨酸(Ser)突變?yōu)樘K氨酸(Thr)后基本不影響ProTα的乙�；�;而突變?yōu)楸彼?Ala)后ProTα的乙�；矫黠@降低,但仍然有少量ProTα被乙酰化修飾;將第一位Ser突變?yōu)楦拾彼?Gly),ProTα則不被乙�；�;將第一位Ser突變?yōu)榧琢虬彼?Met),則引起ProTα的起始甲硫氨酸切割不完全,而切除起始甲硫氨酸的ProTαMet1也無乙�；揎棳F(xiàn)象。將ProTα的第二位天冬氨酸(Asp)突變?yōu)楣劝彼?Glu)或纈氨酸(Val)時,ProTα仍有乙酰化現(xiàn)象,但乙�；矫黠@降低;將第二位的Asp突變?yōu)槔i氨酸(Val)、半胱氨酸(Cys)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)時可引起ProTα不同程度的N-末端降解,其中將第二位Asp突變?yōu)镃ys、Pro時幾乎沒有完整的ProTα存在,ProTαN-末端突變后引起的N-末端降解的機理還不明確,值得進一步深入研究。 綜上所述,ProTα在大腸桿菌DH5α中表達時可獲得N-末端乙�；揎�,該過程主要由RimJ催化。過量的RimL或RimJ可使ProTα幾乎完全被乙�；揎�,而過量的RimI卻抑制ProTα的乙�；揎�。初步研究發(fā)現(xiàn),ProTα的N-末端氨基酸序列不同程度的影響其乙酰化水平,其規(guī)律與真核生物的有相似之處。本研究為原核生物N-末端乙�；揎椀臋C理研究提供了良好的模型,豐富了數(shù)據(jù)資料,為以后的深入研究提供了線索。
【圖文】：

以前認為的那么罕見，只是我們未發(fā)現(xiàn)。.2 胸腺素 α1（Tα1）.2.1 Tα1 的發(fā)現(xiàn)1966 年，Abraham White 和 Allan L. Goldstein 從牛的胸腺組織提取了具有刺激功能的物質，并將其命名為胸腺素(thymosin)，在傳統(tǒng)意義上胸腺素并于激素[16]。早期的部分純化品，胸腺素組分-3(thymosin fraction 3，TF-3)還均一的物質，直至 1972 年，該研究小組獲得了組分-5(thymosin fraction 5，TF圖 1-1），并于 1974 年得到美國 FDA 批準，將 TF-5 開始Ⅰ期臨床試驗，同立了胸腺素活性測定的玫瑰花結方法（圖 1-2）。TF-5 包括 40 種以上分子量kDa-15kDa 之間的小分子酸性多肽，根據(jù)等電點的差異可將其分為 α、β、γ（圖 1-3）。TF-5 中的胸腺素 α1(Tα1)已經(jīng)純化到了純品，并得到其氨基酸序α1 是由 28 個氨基酸組成的小肽，分子量 3108 Da，等電點 4.2，其 N-末端的er 被乙酰化修飾[17]�，F(xiàn)在化學合成的 Tα1（SciClone 公司的“日達仙”）已床上應用。

以前認為的那么罕見，只是我們未發(fā)現(xiàn)。.2 胸腺素 α1（Tα1）.2.1 Tα1 的發(fā)現(xiàn)1966 年，Abraham White 和 Allan L. Goldstein 從牛的胸腺組織提取了具有刺激功能的物質，并將其命名為胸腺素(thymosin)，，在傳統(tǒng)意義上胸腺素并于激素[16]。早期的部分純化品，胸腺素組分-3(thymosin fraction 3，TF-3)還均一的物質，直至 1972 年，該研究小組獲得了組分-5(thymosin fraction 5，TF圖 1-1），并于 1974 年得到美國 FDA 批準，將 TF-5 開始Ⅰ期臨床試驗，同立了胸腺素活性測定的玫瑰花結方法（圖 1-2）。TF-5 包括 40 種以上分子量kDa-15kDa 之間的小分子酸性多肽，根據(jù)等電點的差異可將其分為 α、β、γ（圖 1-3）。TF-5 中的胸腺素 α1(Tα1)已經(jīng)純化到了純品，并得到其氨基酸序α1 是由 28 個氨基酸組成的小肽，分子量 3108 Da，等電點 4.2，其 N-末端的er 被乙�；揎梉17]。現(xiàn)在化學合成的 Tα1（SciClone 公司的“日達仙”）已床上應用。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R378

【參考文獻】

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1 張智清,姚立紅,侯云德;含P_RP_L啟動子的原核高效表達載體的組建及其應用[J];病毒學報;1990年02期

2 王煒;張鴻鵬;黃鶴;;固相片段縮合法制備胸腺素α_1的工藝[J];化學工業(yè)與工程;2008年04期

3 鄒和昌;蔡文;李海龍;顧益;孟凡國;;從豬胸腺提取胸腺素1的工藝[J];清華大學學報(自然科學版);2008年06期

4 李潔;王曉杰;鄒素蘭;;胸腺肽的臨床應用與研究進展[J];中國藥房;2008年14期

5 張曉峰;劉紅梅;;胸腺肽的臨床應用概況[J];中國誤診學雜志;2007年08期

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1 方宏清;胸腺素α1（Tα1）的生物合成研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2009年

本文編號：2521844