【摘要】：目的建立小鼠巨細(xì)胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV)經(jīng)鼻腔感染同種異型皮膚移植BALB/c小鼠急性間質(zhì)性肺炎模型。 方法(一)建立同種異型皮膚移植BALB/c小鼠模型:采用21只供體C57BL/6與84只受體BALB/c雌鼠,背部皮膚移植后,每只小鼠腹腔注射環(huán)孢素(CsA,15mg/kg),連續(xù)給藥14d,在此期間,每天觀察移植小鼠的生存狀況和皮膚存活狀況;在第14d,通過(guò)ELISA法檢測(cè)小鼠血漿中IFN-γ水平。 (二)建立MCMV感染受體小鼠急性間質(zhì)性肺炎模型:(1)實(shí)驗(yàn)分組:將移植14d后的受體小鼠隨機(jī)分為5組(n=16),實(shí)驗(yàn)組為4組分別以1×102 PFU/ml/只(A組),1×103 PFU/ml/只(B組),1×104 PFU/ml/只(C組),1×105PFU/ml/只(D組)不同劑量MCMV懸液鼻腔接種受體BALB/c小鼠,另一組為正常對(duì)照組(E組),每只小鼠鼻腔接種原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts,MEF)懸液50μl/只。(2)檢測(cè)方法:在感染病毒后逐日觀察小鼠的一般變化;并在感染后第5,9,14和21d,無(wú)菌取小鼠肺組織分別做HE染色,MCMV病毒分離,透射電鏡,PCR,RT-PCR檢測(cè)MCMV即刻早期基因(IE)和晚期基因(M55)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和Real timePCR檢測(cè)MCMV IE DNA拷貝數(shù),以及原位雜交和免疫組織化學(xué)試驗(yàn)等方法。 結(jié)果(一)同種異型皮膚移植受體小鼠在移植術(shù)后觀察BALB/c小鼠在連續(xù)14d給藥期間,部分小鼠活動(dòng)能力下降、體重減輕,部分小鼠移植皮片有毛發(fā)生長(zhǎng),大部分移植小鼠移植處可見(jiàn)皮下血管化形成,皮片平均存活時(shí)間(MST)為13.5±0.3d。在移植14d后,通過(guò)ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)受體小鼠比正常小鼠血漿中IFN-γ水平明顯降低(p0.05),表明移植受體小鼠處于免疫抑制狀態(tài),同種異型皮膚移植成功。 (二)(1)觀察感染后各組小鼠的生存狀態(tài),D組小鼠相比其他組有明顯的嗜睡、厭食、體重下降;用統(tǒng)計(jì)軟件分析各組小鼠體重指標(biāo),顯示D組與其他組之間存在顯著差異(P0.01)。(2)各感染組肺組織經(jīng)HE染色,觀察各組小鼠肺組織病理變化,發(fā)現(xiàn)C組和D組小鼠肺組織有局灶性的病理?yè)p害,并發(fā)現(xiàn)感染第14和21d后D組肺組織病理改變最明顯表現(xiàn)為:肺泡內(nèi)出血、肺泡壁增寬、肺泡破裂形成肺大皰、肺上皮細(xì)胞腫大,肺間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡腔變小,以及在肺葉邊緣有代償性肺氣腫產(chǎn)生;(3)病毒分離:各組小鼠在感染后第5,9,14,21d均取肺組織勻漿接種MEF細(xì)胞盲傳3代后,C組和D組在第5,9,14d可見(jiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE),陽(yáng)性率分別為37.5%和62.5%,低劑量組未見(jiàn)CPE;(4)在感染后的5,9,14,21d,檢測(cè)各感染組MCMV IE和M55 DNA和RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,結(jié)果為各感染組MCMV IE和M55 DNA均為陽(yáng)性;各感染組MCMV IE mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為陽(yáng)性,在感染后的9,14,21d,M55 mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物陽(yáng)性率分別為43.8%,62.5%,75%,病毒處于活動(dòng)性感染狀態(tài);(5)Real timePCR檢測(cè)各感染組小鼠肺組織中MCMV IE DNA拷貝數(shù)發(fā)現(xiàn)高劑量組(C和D組)在21d內(nèi)病毒拷貝數(shù)有明顯的變化,在第5和9d高于第14和21d,第9d達(dá)到峰值,此時(shí)C組最高拷貝數(shù)為(1.35±0.10×104copies/μg),D組最高拷貝數(shù)為(5.57±0.15×104copies/μg),且D組病毒拷貝數(shù)最高,在感染第14d,C和D組病毒拷貝數(shù)分別為1.81±0.24×102copies/μg和2.05±0.05×103copies/μg,病毒拷貝數(shù)相對(duì)有所降低,低劑量組(A和B組)MCMV IE DNA拷貝數(shù)變化不明顯;(6)經(jīng)透射電鏡檢測(cè)各組小鼠肺組織可見(jiàn)C組和D組上皮細(xì)胞內(nèi)有皰疹樣病毒顆粒;(7)發(fā)現(xiàn)C和D組小鼠肺組織原位雜交和免疫組織化學(xué)檢測(cè)均在肺間質(zhì)上皮細(xì)胞中檢測(cè)病毒特異性核酸和蛋白,而在正常對(duì)照組小鼠肺組織中均為陰性。 結(jié)論(一)依據(jù)小鼠移植皮膚的存活時(shí)間和免疫抑制狀態(tài)確定建立了同種異型皮膚移植小鼠模型。 (二)在感染MCMV后的不同時(shí)間,對(duì)各組受體小鼠肺組織的HE染色、透射電鏡、原位雜交和免疫組化檢測(cè),可見(jiàn)病毒存在肺組織上皮細(xì)胞內(nèi),高劑量組肺組織病理檢測(cè)可見(jiàn)典型的間質(zhì)性肺炎樣病變,并發(fā)現(xiàn)感染后14和21d肺組織損傷較為嚴(yán)重;通過(guò)病毒分離,PCR,RT-PCR和Real timePCR等檢測(cè),可見(jiàn)病毒IE和M55 DNA,mRNA存在,即病毒處于活動(dòng)性感染狀態(tài),感染后高劑量組病毒拷貝數(shù)變化較明顯,第9d病毒拷貝數(shù)最高,第14和21d病毒拷貝數(shù)相對(duì)減少,第21d后病毒可能趨于潛伏狀態(tài)。綜上所述,本研究成功建立了模擬自然感染狀態(tài)下同種異型皮膚移植后MCMV感染所致的小鼠急性間質(zhì)性肺炎模型。
【圖文】：

安徽醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文果種異型皮膚移植小鼠模型移植受體小鼠的移植物的存活狀態(tài)同種異型皮膚移植受體小鼠在移植術(shù)后觀察 BALB/c 小鼠在連續(xù) 1部分小鼠活動(dòng)減緩、體重下降，大部分移植小鼠移植處可見(jiàn)皮下血小鼠移植皮片有毛發(fā)生長(zhǎng)，皮片平均存活時(shí)間(MST)為 13.5±0.3d，明顯的排斥反應(yīng)，皮膚移植成功，見(jiàn)圖 1。ABCC57BL/6BALB/c 注射 CsA 前

與正常小鼠相比，小鼠皮膚移植后機(jī)體表 4.小鼠血漿中 IFN-γ Tab 4. the IFN-γ levels in plasma of組x±S（pg/ml） 小鼠 26.073±0.92小鼠 22.753±0.51試驗(yàn)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果，，見(jiàn)圖 2，計(jì)算出 MCMV 病毒懸m1，分裝為 1ml/管后于-80℃保存?zhèn)溆谩?
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R-332

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 張俊玲;王明麗;;人巨細(xì)胞病毒蝕斑實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化及在抗病毒物質(zhì)活性測(cè)定中的應(yīng)用[J];安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2007年05期

2 曾文彤,葉青,羅光華,董選,何小舟;動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腎移植受者白細(xì)胞中巨細(xì)胞病毒DNA載量[J];中華器官移植雜志;2005年06期

本文編號(hào)：2521637