本文關(guān)鍵詞：鼠疫耶爾森氏菌外源獲得性質(zhì)粒編碼小RNA的篩選、鑒定與功能的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景鼠疫是一種自然疫源性疾病,其病原菌是鼠疫耶爾森氏菌(以下簡(jiǎn)稱(chēng)鼠疫菌)鼠疫菌共含有3個(gè)質(zhì)粒,即pCD1、pMT1和pPCP1,pCD1質(zhì)粒為鼠疫菌和假結(jié)核耶爾森氏菌所共有,pMT1與pPCP1質(zhì)粒則是鼠疫菌在進(jìn)化過(guò)程中外源性獲得的,為鼠疫菌所特有,與鼠疫菌的致病性密切相關(guān)。細(xì)菌中除了蛋白類(lèi)的調(diào)控因子之外,還存在許多發(fā)揮調(diào)控作用的非編碼RNA(non-coding RNA),在細(xì)菌中也稱(chēng)作小RNA(small RNA,小 RNA)。小RNA作為調(diào)節(jié)子,可參與細(xì)菌內(nèi)鐵代謝、糖代謝、群體感應(yīng)、外膜蛋白合成、毒力等生理功能的調(diào)控,對(duì)原核生物生理和毒力發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)在不同條件下生長(zhǎng)的鼠疫菌提取它的總RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,新發(fā)現(xiàn)了104個(gè)小RNA,其中包括pMT1與pPCP1質(zhì)粒上的多個(gè)小RNA,而這兩個(gè)質(zhì)粒又是鼠疫菌在進(jìn)化過(guò)程中獲得的,因此驗(yàn)證pMT1與pPCP1質(zhì)粒上小RNA的功能是鼠疫菌致病機(jī)制研究的重要組成部分。本研究旨在利用Northern blot驗(yàn)證新發(fā)現(xiàn)的小RNA,并構(gòu)建小RNA的基因缺失株,通過(guò)一系列的表型篩選實(shí)驗(yàn),初步探究了小RNA對(duì)鼠疫菌生存能力和致病能力的影響。結(jié)果與討論：(1) 利用Northern blot實(shí)驗(yàn)方法共確定了10個(gè)小RNA的存在,分別為sRl8、sR3425、sR3457、sR3461、sR3446、sR3411、sR4338、sR4340、sR6142和sR6143,又對(duì)本次確定的小RNA和前期驗(yàn)證的部分小RNA做了大小和Hfq依賴(lài)性的驗(yàn)證。驗(yàn)證大小的小RNA有sR16、sR271、sR82、sR138、sR524、sR503、sR3446、sR3457、sR3461、sR4338、sR4340、sR6142、sR6143、sR18和sR3411共15個(gè),這些小RNA的大小基本和預(yù)測(cè)結(jié)果一致。sR16、sR4338、sR82、sR138和sR510在野生株的表達(dá)量高于Hfq突變株,因此這些小RNA的穩(wěn)定表達(dá)依賴(lài)于Hfq蛋白,sR271、sR363、sR524、sR3461、sR18和sR3411在野生株中和Hfq突變株中的表達(dá)量幾乎一樣,且sR503和sR147在野生株中的表達(dá)量低于突變株,這些小RNA的穩(wěn)定表達(dá)不依賴(lài)于Hfq蛋白。(2)采用基于λRed重組系統(tǒng)的基因突變技術(shù),共成功構(gòu)建了16株小RNA缺失株分別是ΔsR4338、ΔsR4339、ΔsR4340、ΔsR3457、ΔsR3446、ΔsR6143、ΔsR378、ΔsR3383、ΔsR3440、ΔsR18、ΔsR6094、ΔsR3411、ΔsR6106、ΔsR6097、ΔsR3425和ΔsR3438。同時(shí)在缺失株的基礎(chǔ)上成功構(gòu)建了一株過(guò)表達(dá)株,即pBAD-sR3383。(3)利用表型和毒力實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證這些小RNA對(duì)鼠疫菌的生理和毒力的調(diào)控關(guān)系。在生物膜形成方而,sR3446缺失后,鼠疫菌的菌落表而比野生株光滑,因此sR3446可能正調(diào)控鼠疫菌生物膜的形成。當(dāng)sR3425、sR3383、sR3457和sR6143缺失后,鼠疫菌菌落表而變得更加粗糙,因此這幾個(gè)小RNA可能負(fù)調(diào)控鼠疫菌生物膜的形成�；诖宋覀冇诌M(jìn)行了結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn),對(duì)生物膜形成情況做定量分析,結(jié)果顯示sR3446、sR3425、sR3383、sR3457和sR6143對(duì)鼠疫菌生物膜形成的調(diào)控與菌落表面褶皺實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。我們通過(guò)在正常條件、高鹽條件和酸性條件下培養(yǎng)鼠疫菌野生株和小RNA突變株分析不同菌株在脅迫條件下生長(zhǎng)速率的變化,從而驗(yàn)證小RNA對(duì)鼠疫菌生存能力的影響,結(jié)果顯示只有ΔsR3425缺失株在這三種條件下的生長(zhǎng)速率均低于野生株,因此sR3425能夠增強(qiáng)鼠疫菌應(yīng)對(duì)外界環(huán)境變化的能力。我們通過(guò)小鼠攻毒實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了小RNA對(duì)鼠疫菌毒力的影響,利用軟件GraphPad Prism 5對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析并計(jì)算鼠疫菌野生株和小RNA突變株生存曲線差異的P值,當(dāng)P值≤0.05時(shí)認(rèn)為兩者的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,結(jié)果顯示：ΔsR3440、ΔsR3383、ΔsR378、Δ sR6094、4 sR3411、Δ sR4339和ΔsR6097的P值分別為0.0258、0.0075、0.0004、0.0003、0.0267、0.0156和0.0143,因此我們認(rèn)為這些小RNA能夠影響鼠疫菌的毒力。
【關(guān)鍵詞】：鼠疫菌 小RNA 生物膜 毒力
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R378
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 本文研究中所用縮略詞8-12
• 前言12-20
• 1. 鼠疫菌的危害12
• 2. 鼠疫菌的生化特征和致病機(jī)理12-13
• 3. 鼠疫菌和假結(jié)核菌的比較13
• 4. 細(xì)菌小RNA的研究13-17
• 4.1 細(xì)菌小RNA的概念和特征13-14
• 4.2 細(xì)菌小RNA的分類(lèi)14-15
• 4.3 小RNA與其伴侶分子Hfq15
• 4.4 細(xì)菌小RNA的功能15-17
• 5. 鼠疫菌小RNA的研究17-18
• 6. 研究目的與意義18-19
• 7. 技術(shù)路線19-20
• 第一章 小RNA的鑒定20-38
• 1. 引言20-21
• 2. 實(shí)驗(yàn)材料21-24
• 2.1 菌株21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)所用試劑21-22
• 2.3 實(shí)驗(yàn)儀器22-23
• 2.4 溶液配制23-24
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法24-33
• 3.1 鼠疫菌的培養(yǎng)24-25
• 3.2 總RNA的提取25-27
• 3.3 體外轉(zhuǎn)錄制備小RNA探針27-30
• 3.4 Northern Blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證30-33
• 4. 結(jié)果與分析33-38
• 4.1 PCR擴(kuò)增線性DNA模板33-34
• 4.2 地高辛標(biāo)記的RNA探針的制備34-35
• 4.3 總RNA質(zhì)量檢測(cè)35
• 4.4 Northern Blot驗(yàn)證小RNA35-37
• 4.5 討論37-38
• 第二章 鼠疫菌小RNA突變株的構(gòu)建38-52
• 1. 引言38-40
• 2. 實(shí)驗(yàn)材料40
• 2.1 菌株和質(zhì)粒40
• 2.2 主要試劑40
• 2.3 主要儀器與試劑配制40
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法40-49
• 3.1 小RNA突變株的構(gòu)建40-45
• 3.2 小RNA過(guò)表達(dá)株的構(gòu)建45-49
• 4. 結(jié)果與分析49-52
• 4.1 小RNA缺失株的構(gòu)建49-51
• 4.2 小RNA過(guò)表達(dá)株的構(gòu)建51
• 4.3 討論51-52
• 第三章 小RNA生理和毒力的研究52-68
• 1. 引言52
• 2 實(shí)驗(yàn)材料52-56
• 2.1 菌株52-53
• 2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物53
• 2.3 主要試劑53-54
• 2.4 主要儀器54
• 2.5 溶液和培養(yǎng)基的配制54-56
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法56-58
• 3.1 鼠疫菌小RNA對(duì)生物膜形成的影響56-57
• 3.2 鼠疫菌小RNA對(duì)其生長(zhǎng)的影響57
• 3.3 鼠疫菌小RNA對(duì)高鹽環(huán)境耐受的影響57
• 3.4 鼠疫菌小RNA對(duì)酸性環(huán)境耐受的影響57-58
• 3.5 小鼠存活實(shí)驗(yàn)58
• 4. 結(jié)果與分析58-68
• 4.1 小RNA對(duì)鼠疫菌生物膜形成的影響58-61
• 4.2 小RNA對(duì)鼠疫菌在不同生長(zhǎng)條件下的影響61-65
• 4.3 小RNA對(duì)鼠疫菌毒力的影響65-66
• 4.4 討論66-68
• 參考文獻(xiàn)68-76
• 附錄76-88
• 致謝88-89
• 碩士期間發(fā)表的論文89

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前6條

1 劉福芮;鐘志軍;周紫\

本文編號(hào)：252156