本文關鍵詞：鼠疫耶爾森氏菌外源獲得性質粒編碼小RNA的篩選、鑒定與功能的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景鼠疫是一種自然疫源性疾病,其病原菌是鼠疫耶爾森氏菌(以下簡稱鼠疫菌)鼠疫菌共含有3個質粒,即pCD1、pMT1和pPCP1,pCD1質粒為鼠疫菌和假結核耶爾森氏菌所共有,pMT1與pPCP1質粒則是鼠疫菌在進化過程中外源性獲得的,為鼠疫菌所特有,與鼠疫菌的致病性密切相關。細菌中除了蛋白類的調控因子之外,還存在許多發(fā)揮調控作用的非編碼RNA(non-coding RNA),在細菌中也稱作小RNA(small RNA,小 RNA)。小RNA作為調節(jié)子,可參與細菌內鐵代謝、糖代謝、群體感應、外膜蛋白合成、毒力等生理功能的調控,對原核生物生理和毒力發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。本研究利用高通量測序技術對在不同條件下生長的鼠疫菌提取它的總RNA進行轉錄組測序,新發(fā)現了104個小RNA,其中包括pMT1與pPCP1質粒上的多個小RNA,而這兩個質粒又是鼠疫菌在進化過程中獲得的,因此驗證pMT1與pPCP1質粒上小RNA的功能是鼠疫菌致病機制研究的重要組成部分。本研究旨在利用Northern blot驗證新發(fā)現的小RNA,并構建小RNA的基因缺失株,通過一系列的表型篩選實驗,初步探究了小RNA對鼠疫菌生存能力和致病能力的影響。結果與討論：(1) 利用Northern blot實驗方法共確定了10個小RNA的存在,分別為sRl8、sR3425、sR3457、sR3461、sR3446、sR3411、sR4338、sR4340、sR6142和sR6143,又對本次確定的小RNA和前期驗證的部分小RNA做了大小和Hfq依賴性的驗證。驗證大小的小RNA有sR16、sR271、sR82、sR138、sR524、sR503、sR3446、sR3457、sR3461、sR4338、sR4340、sR6142、sR6143、sR18和sR3411共15個,這些小RNA的大小基本和預測結果一致。sR16、sR4338、sR82、sR138和sR510在野生株的表達量高于Hfq突變株,因此這些小RNA的穩(wěn)定表達依賴于Hfq蛋白,sR271、sR363、sR524、sR3461、sR18和sR3411在野生株中和Hfq突變株中的表達量幾乎一樣,且sR503和sR147在野生株中的表達量低于突變株,這些小RNA的穩(wěn)定表達不依賴于Hfq蛋白。(2)采用基于λRed重組系統(tǒng)的基因突變技術,共成功構建了16株小RNA缺失株分別是ΔsR4338、ΔsR4339、ΔsR4340、ΔsR3457、ΔsR3446、ΔsR6143、ΔsR378、ΔsR3383、ΔsR3440、ΔsR18、ΔsR6094、ΔsR3411、ΔsR6106、ΔsR6097、ΔsR3425和ΔsR3438。同時在缺失株的基礎上成功構建了一株過表達株,即pBAD-sR3383。(3)利用表型和毒力實驗,驗證這些小RNA對鼠疫菌的生理和毒力的調控關系。在生物膜形成方而,sR3446缺失后,鼠疫菌的菌落表而比野生株光滑,因此sR3446可能正調控鼠疫菌生物膜的形成。當sR3425、sR3383、sR3457和sR6143缺失后,鼠疫菌菌落表而變得更加粗糙,因此這幾個小RNA可能負調控鼠疫菌生物膜的形成�；诖宋覀冇诌M行了結晶紫實驗,對生物膜形成情況做定量分析,結果顯示sR3446、sR3425、sR3383、sR3457和sR6143對鼠疫菌生物膜形成的調控與菌落表面褶皺實驗結果基本一致。我們通過在正常條件、高鹽條件和酸性條件下培養(yǎng)鼠疫菌野生株和小RNA突變株分析不同菌株在脅迫條件下生長速率的變化,從而驗證小RNA對鼠疫菌生存能力的影響,結果顯示只有ΔsR3425缺失株在這三種條件下的生長速率均低于野生株,因此sR3425能夠增強鼠疫菌應對外界環(huán)境變化的能力。我們通過小鼠攻毒實驗驗證了小RNA對鼠疫菌毒力的影響,利用軟件GraphPad Prism 5對實驗結果進行分析并計算鼠疫菌野生株和小RNA突變株生存曲線差異的P值,當P值≤0.05時認為兩者的差異有統(tǒng)計學意義,結果顯示：ΔsR3440、ΔsR3383、ΔsR378、Δ sR6094、4 sR3411、Δ sR4339和ΔsR6097的P值分別為0.0258、0.0075、0.0004、0.0003、0.0267、0.0156和0.0143,因此我們認為這些小RNA能夠影響鼠疫菌的毒力。
【關鍵詞】：鼠疫菌 小RNA 生物膜 毒力
【學位授予單位】：安徽大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R378
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-8
• 本文研究中所用縮略詞8-12
• 前言12-20
• 1. 鼠疫菌的危害12
• 2. 鼠疫菌的生化特征和致病機理12-13
• 3. 鼠疫菌和假結核菌的比較13
• 4. 細菌小RNA的研究13-17
• 4.1 細菌小RNA的概念和特征13-14
• 4.2 細菌小RNA的分類14-15
• 4.3 小RNA與其伴侶分子Hfq15
• 4.4 細菌小RNA的功能15-17
• 5. 鼠疫菌小RNA的研究17-18
• 6. 研究目的與意義18-19
• 7. 技術路線19-20
• 第一章 小RNA的鑒定20-38
• 1. 引言20-21
• 2. 實驗材料21-24
• 2.1 菌株21
• 2.2 實驗所用試劑21-22
• 2.3 實驗儀器22-23
• 2.4 溶液配制23-24
• 3. 實驗方法24-33
• 3.1 鼠疫菌的培養(yǎng)24-25
• 3.2 總RNA的提取25-27
• 3.3 體外轉錄制備小RNA探針27-30
• 3.4 Northern Blot實驗驗證30-33
• 4. 結果與分析33-38
• 4.1 PCR擴增線性DNA模板33-34
• 4.2 地高辛標記的RNA探針的制備34-35
• 4.3 總RNA質量檢測35
• 4.4 Northern Blot驗證小RNA35-37
• 4.5 討論37-38
• 第二章 鼠疫菌小RNA突變株的構建38-52
• 1. 引言38-40
• 2. 實驗材料40
• 2.1 菌株和質粒40
• 2.2 主要試劑40
• 2.3 主要儀器與試劑配制40
• 3. 實驗方法40-49
• 3.1 小RNA突變株的構建40-45
• 3.2 小RNA過表達株的構建45-49
• 4. 結果與分析49-52
• 4.1 小RNA缺失株的構建49-51
• 4.2 小RNA過表達株的構建51
• 4.3 討論51-52
• 第三章 小RNA生理和毒力的研究52-68
• 1. 引言52
• 2 實驗材料52-56
• 2.1 菌株52-53
• 2.2 實驗動物53
• 2.3 主要試劑53-54
• 2.4 主要儀器54
• 2.5 溶液和培養(yǎng)基的配制54-56
• 3. 實驗方法56-58
• 3.1 鼠疫菌小RNA對生物膜形成的影響56-57
• 3.2 鼠疫菌小RNA對其生長的影響57
• 3.3 鼠疫菌小RNA對高鹽環(huán)境耐受的影響57
• 3.4 鼠疫菌小RNA對酸性環(huán)境耐受的影響57-58
• 3.5 小鼠存活實驗58
• 4. 結果與分析58-68
• 4.1 小RNA對鼠疫菌生物膜形成的影響58-61
• 4.2 小RNA對鼠疫菌在不同生長條件下的影響61-65
• 4.3 小RNA對鼠疫菌毒力的影響65-66
• 4.4 討論66-68
• 參考文獻68-76
• 附錄76-88
• 致謝88-89
• 碩士期間發(fā)表的論文89

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前6條

1 劉福芮;鐘志軍;周紫\

本文編號：252156